Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 103

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 122 >> Следующая

на 50 или 100 мКл.
Микропипетка на 50 или 100 мЖл со сменными даконечника-
(МИ.
Бунзеновская горелка.
Сосуд с дистиллированной водой.
Фильтровальная бумага.
Нормальная кроличья сыворотка .(лучше всего сыворотка крови, взятой у
кролиКа до начала иммунизации).
Раствор Олсвера:1 де'кстроза, 2,05% (вес на объем);
NaCl, /0,42% (вес на объем); цитрат натрия, '• 0,3% (вес на объем);
лимонная кислота, 0,055%) (вес на объем). Раствор стерилизуют
фильтрованием.
Кроличьи антитела к для получения IgM кровь отбирают ЭБ: в коде первичного
иммунного ответа.
Для получения IgG кровь отбирают после повторной иммунизации (ом., гл. 2,
разд. 6.7.2).
Свежие ЭБ в растворе Олсвера.
Фосфатный буферный раствор (PBS), pH 7,2.
0.1.М 2-МЭ в PBS.
Маркирующий карандаш.
2.2. Постановка реакции
1. ТрижДы отмываю'т ЭБ в PBS, удаляя после первого отмывания пленку
эритроцитов. Готовят достаточное количество '0,5%|-ной (объем на объем)
суспензии. Можно использовать суспензии в концентрации до 2%, однако
следует учитывать, что это .влияе'т ,как на общую картину агглютинации,
так и на конечный титр агглютинации и гемолиза.
2. На панели для микротитрования отмечают первый и последний ряды ,(А и
Н) и затем попарно объединяют оставшиеся ряды '(например, В и ,С, D и Е,
F и G) (рис. 7.1 и 7.2).
3. В каждую лунку вносят по 50 или 100 мкл PBS.
16*
244
Г.ПЯПЯ 7
4. Прокаливают добела в пламени горелки петлю для приготовления
разведения и затем охлаждают ее, погружая в дистиллированную воду.
Промакивают петлю фильтровальной бумагой (не вытирать!) и очень -
осторожно прикасаются к мениску нормальной кроличьей сыворотки (не
погружать петлю в раствор!). Вносят петлю в лунку 1 .ряда А, вращают
несколько раз, а затем переносят в вертикальном положении в лунку 2 и т.
д. вплоть до лунки 12. В конце промывают'петлю дистиллированной водой ,и
и 'про'каливают. Ряд А - это контроль (нормальная кроличья сыворотка)
(ом. рис. 7.2).
5. Повторяют описанную выше процедуру с тремя исследуемыми сыворотками,
но в этом случае используют объединенные ряды (на'пример, В и С в
качестве двойного повтора разведений). В лунки ряда Н сыворотку не вносят
(см. рис. 7.2).
6. В лунки рядов А, .В, D, .F и Н добавляют один объем PBS.
7. В лунки рядов |С, Е и G вместо PBS добавляют аналогичный объем 0,1 М
2-МЭ. 2-Мер'каитоэтанол следует добавлять под тягой и с этого момента
панель должна находиться только под крышкой ((за исключением тех
моментов, когда необходимо добавить реагенты ,или оценить результат).
8. Добавляют в каждую лунку по 50 или 100 мкл свежере-суспендированных ЭБ
и закрывают панель крышкой.
9. Держа панель над белым фоном, осторожно перемешивают клетки, вращая ее
и слегка постукивая по краям.
1 10. Панель оставляют на 2 ч ,или на ночь при ,4 °С для то-
го, чтобы дать эритроцитам осесть. Реакцию можно ускорить, <проводя ее
при ,37 °С; осаждение же клеток не зависит от температуры.
2.3. Интерпретация результатов и технические замечания
i 1. Многие нормальные (неиммунные) сыворотки содержат фоновые
(гетерофильные) антитела к (ЭБ, обычно в низких титрах. Иногда в первой
лунке разведения нормальной сыворотки можно наблюдать агглютинацию
(эритроцитов.
2. Чувствительность теста обычно повышается при использовании 0,5%-ной
клеточной с'успензии по сравнению с более ¦концентрированными.
3. В реакции гемагглютинации преимущественно выявляются IgM не только
,из-за поливалентности этих антител >(пять функционально активных
антигенсвязывающих центров в отличие от д'вух у IgG), но .и из-за
большого размера молекулы IgM. Поскольку клетки, агглютинированные IgM,
находятся на большом удалении друг от друга, то уменьшается
Гемагглютинации и реакции антителозависимого гемолиза
245
сила взаимного оталкивания клеток, обусловленная их дзета-потенциалом.
I 4. Влияние обработки сыворотки 2-МЭ на снижение IgM-зависимой
агглютинации можно наблюдать при первичном образовании антител к ЭБ (см.
рис. 7.2). Остаточные агглютинирующие свойства 'сыворотки обусловлены
наличием в ней IgG. Кроличьи антитела к ЭБ класса G менее гетероген-ны по
своим агглютинирующим свойствам по сравнению с антителами некоторых
других видов животных. В последнем случае может потребоваться
дополнительное использование антиглобулинового реагента для того, чтобы
обнаружить связанные с эритроцитами IgG, обладающие слабой (или не
обладающие ,совсем) агглютинирующей активностью (см. разд. 4).
| 5. Незначительное число доступных для IgG антигенных
детерминант на поверхности эритроцитов можёт в некоторых случаях
обусловить слабо выраженную агглютинацию. И наоборот, эффективную
агглютинацию преимущественно вызывают антитела класса М (около 5-105
доступных антигенных детерминант на клетку).
* 6. В контрольных лунках, не содержащих сыворотки, не
должно наблюдаться спонтанной агглютинации клето'к. Такая проблема редко
возникает при использовании свежих клеток, обладающих высоким
отрицательным поверхностным зарядом. Если же используют эритроциты,
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed