Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 102

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 122 >> Следующая

ж которым относятся, например, IgG человека к резус-антигену. Зта
реакция, называемая пробой Кумбса, отличается высокой чувствительностью.
Она применяется и в других целях; например, если в распоряжении
исследователя имеются изотипСпецифические антиглобулиНы, то с их помо-
Гемагглютииация и реакции антителозависимого гемолиза
241-
щью можно определить (как в ,прямой, так и в 'пассивной модификации)
класс, а также подкласс IgG, связанных с эритроцитами в
субагглютинирующих дозах. Используя стандартные .Препараты .эритроцитов,
нагруженных иммуноглобулинами, пробу Кумбса мож1но применять для
сравнения титров и специфичности приготовленных антиглобулиновых
'реагентов.
2-Мер'каптоэтанол (2-МЭ) может вызывать диссоциацию IgM-пентамеров, р
результате .чего они утрачивают агглютинирующую способность. Поэтому
добавление данного 'реагента приводит к тому, что в реакции агглютинации
участвуют лишь IgG, что позволяет сравнивать титры IgM и IgG. Антитела,
связывающие комплемент (источником которого служит свежая сыворотка), в
его присутствии вызывают лизис эритроцитов-мишеней. У большинства видов
животных лишь некоторые подклассы IgG способны связывать комплемент; в то
же время IgM обладают более высокой комплемент-свя-зывающей активностью.
Поэтому антисыворотки с .высоким содержанием IgM имеют более высокий
гемолитический титр, чем сыворот'.ки, в составе которых преобладают JgG.
Гемолитические тесты, в делом, более чувствительны, чем агглюти-национные
- разумеется, лишь в том случае, если участвующие Iв реакции антитела
связывают комплемент. Поскольку 2-МЭ обладает способностью ингибировать
связывание комплемента IgM, он заметно снижает гемолитический титр
антисывороток с высо'ким содержанием антител этого 'класса. В результате
можно определить концентрацию IgM в -сыворотке (ом. рис. 7.2).
Реакция 'пассивной гемагглютинации, когда с Поверхностью эритроцитов
связан чужеродный антиген, отличается высокой чувствительностью и может
.быть использована для определения свободного антигена. ;.В этом случае
применяет .предварительно оттитрованную агглютинирующую сыворотку в
минимальном разведении. Антиген, находящийся в растворе даже в очень
незначительной концентрации, легко ингибирует агглютинацию эритроцитов
сывороточными антителами. Используя стандартные ингибирующие разведения,
реакцию мож:но учитывать количественно.
2. Прямая реакция гемагглютинации
Прямая реакция гемагглютинации - это простой, чувствительный метод
титрования антител к поверхностным антигенам эритроцитов. Он
.предусматривает приготовление последовательных разведений 'антител
(объем проб 50или 100мкл) в лунках панели для микротитрования с U-
образвы'м дном с
16-997
i242
Глава 7
Рис. 7.2. Постановка реакций прямой гемагглютииации и прямого гемолиза,
демонстрирующих эффект предварительной обработки сыворотки 2-мер-
каптоэтаиолом (2МЭ). Сыворотки, тестируемые в рядах В и С, D и Е,
получены после первичной иммунизации (преобладают IgM). Комплемент
добавляли в лунки рядов D и Е для демонстрации литической активности IgM
и ее изменения после добавления 2-МЭ (ряд Е). Сыворотки, тестируемые в
рядах F и G, получены в ходе вторичного иммунного ответа (преобладают
IgG), поэтому 2-МЭ оказывает меиыпий эффект на агглютинацию (ряд G). В
лунках G6, G7 и G8 наблюдается! агглютинация без лизиса.
Интерпретация результатов приведена в разд. 2.2, 2.3 и 3.4.2 (п. 5)
последующим добавлением стандарной разбавленной суспензии клетс'к
(напри'мер, 0,5%-ной, объем на объем). За'тем Клеткам дают осесть при
комнатной температуре. Титр определяют по конечному разведению антител,
при котором в лун-*ке еще учитывается реакция агглютинации. При
отрицательном результате клетки оседают на дне лунки в виДе компактной
"бляшки", в то время как агглютинировавшие эритроциты образуют в лунке
округлое 'по форме скопление клеток, ¦имеющее довольно большой диаметр.
Дри эффективной агглютинации это скопление может иметь извилистый край.
Данный тест высокочувствителен и в случае антител с низкой аффинностью
при условии, что антиген хорошо э'капрессиро-<ван на поверхности клетки.
Приведенная ниже методика описывает титрование антител к ЭБ ((например,
антител, полученных от кроликов). Такие антитела Специфичны по отношению
к нескольким антигенам ЭБ. Несмотря на довольно ограниченную область
применения данного теста, он представляет собой прекрасную модель для
изучения (принципов метода темагглютинации и интерпретации результатов.
Тест можно
Гемагглютинации и реакции антителозависимого гемолиза
243;
модифицировать, если необходимо продемонстрировать агглютинацию и гемолиз
с помощью -IgG и IgM. На рис. 7.2 ¦приведен п'ример титрования для
иллюстрации различных •аспектов тест-системы.
2.1. Оборудование и реагенты (см. также приложение)
Пластиковые панели для миКротитрования с U-образньгми лунками, снабженные
крышками.
Специальные приспособления (петли) для приготовления разведений в лунках
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed