Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
электрофореза, кратко изложенной выше, достаточно, чтобы мы могли понять,
почему и(0) - величина постоянная. Если в ДСН-белковых комплексах весовое
содержание ДСН сохраняется на постоянном уровне и можно пренебречь
зарядом самого белка, то суммарный заряд г комплекса прямо пропорционален
молекулярной массе и тем самым длине / комплекса, так как последний имеет
форму стержня. Коэффициент трения также приблизительно пропорционален
массе молекулы; зто видно из формулы / = бжг] ylQypF. Для стержнеобразной
молекулы объем гидратированной формы прямо пропорционален ее длине.
Фактор формы F можно оценить с помощью уравнения (10.19а) для вытянутых
эллипсоидов. При очень больших значениях a/b F = (a/b)2/i In (a/b). Но
отношение осей в случае стержня просто пропорционально его длине, так
что/ ос /1/3 • /2/3/1п 1=1 для больших /. Таким образом, поскольку
подвижность и(0) ос z/f, она не зависит от молекулярной массы молекулы.
Поэтому оказывается, что при электрофорезе в присутствии ДСН действие
электрического поля просто сводится к тому, что на все такие молекулы
накладывается общий дрейф с постоянной скоростью. А их разделение,
опирающееся на разницу в значениях молекулярных масс, объясняется
спецификой взаимодействия стержневидных ДСН-белковых комплексов разных
размеров с несущей матрицей геля.
Уравнение (12.74) показывает, что подвижность молекул падает по мере
того, как уменьшается содержание растворителя в геле. Структура самого
геля ничем не отличается от структуры зерна, изображенного на рис. 12.14.
Однако гель заполняет весь объем системы, там нет никаких свободных от
геля областей вроде тех, что имеются между зернами в колонке для гель-
хроматографии. Когда электрическое поле вынуждает молекулы двигаться в
толще геля, то для самых мелких из них находится, как правило, достаточно
большое число пор, через которые они могут мигрировать. Более крупным
молекулам придется пройти большее миграционное расстояние, поскольку не
все поры из предыдущего множества достаточно велики для того, чтобы
пропустить их. Отсюда следует, что при движении в геле у более крупных
молекул результирующая подвижность меньше. Уравнение (12.58) показывает,
что коэффициент распределения а прямо пропорционален части площади
поперечного сечения, доступной для данного растворенного вещества,
поскольку для сплошного геля "свободная" площадь а равна нулю. Поэтому
результирующая подвижность должна быть пропорциональна а. Тогда, учитывая
уравнение (12.66а), мы можем предсказать зависимость вида
и = b - a lg М (12.75)
Коэффициент b должен зависеть от подвижности и(0) при нулевой
концентрации геля, а также от характера распределения пор в геле по их
размерам. Параметр а должен быть функцией концентрации геля С, что
следует из условия совместимости уравнений (12.74) и (12.75).
ДРУГИЕ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
305
ИФ
РИС. 12.19. Двумерный электрофорез в геле, получающийся при наложении
ДСН-электрофореза на изоэлектрическое фокусирование. Сначала исследуемый
материал подвергают электрофорезу в одномерном геле с градиентом pH
(изоэлектрическое фокусирование). Затем эту полоску с гелем прикладывают
к одной из сторон квадратной пластины геля с ДСН, в котором исследуемое
вещество движется под прямым углом к направлению движения в первом геле.
Картина, которая здесь изображена, получена для суммарного белка Е. coir,
регистрация ведется с помощью радиоавтографии. Подробное описание этой
методики содержится у О'Фаррела. [Радиоавтограмма приведена с любезного
разрешения Патрика О'Фаррела. O'Farrell P., J.Biol. Chem., 250, 4007
(1975).]
Наблюдаемые на опыте подвижности белков при электрофорезе в присутствии
ДСН зависят от молекулярной массы в полном соответствии с уравнением
(12.75). На рисунке 12.18,С показаны типичные результаты таких измерений.
Те же рассуждения, которые мы приводили при обсуждении электрофореза
белков в присутствии ДСН, годятся и для случая нуклеиновых кислот в
обыкновенных водных буферах. Однако очень длинные молекулы уже нельзя
рассматривать как жесткие стержни. В этом случае следует пользоваться
аналогом уравнения (12.75), в котором вместо молекулярной массы
фигурирует эффективный радиус гидратированной формы клубкообразной
молекулы. Отградуировав систему с гелем, мы сможем определить Ггидр,
величина которого в сочетании с седи-ментационными данными позволит нам
получить правильное значение молекулярной массы точно так же, как это
было описано ранее в разделе, посвященном гель-хроматографии.
Главное преимущество электрофореза в геле перед гель-хроматографией
состоит в том, что в продолжение всего процесса зоны имеют очень резкие
границы, поскольку нет никаких свободных от геля областей, где диффузия
могла бы протекать быстро. Разделительная способность электрофореза в
присутствии ДСН опирается лишь на разницу в моле-
20 84
ГЛАВА 12
кулярных массах, а при изоэлектрическом фокусировании целиком зависит от
зарядов молекул. Логично предположить, что если бы нам удалось объединить
