Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
оба метода в одну разделительную схему, то ее разрешающая способность
была бы весьма значительной. Это достигается посредством двумерного
электрофореза, при котором в одном направлении происходит электрофорез в
присутствии ДСН, а в другом - изоэлектрическое фокусирование. На рис.
12.19 показан пример применения подобной процедуры, взятый из работы
О'Фаррела. Один аналитический опыт позволяет идентифицировать более 1000
различных белков из Е. coli.
Краткие выводы
Характеристическая вязкость является мерой прироста вязкости раствора за
счет присутствия в нем растворенных макромолекул1*. Характеристическая
вязкость сферических частиц не зависит от их массы, но в общем случае она
очень чувствительна к форме и конформации молекул. Характеристические
вязкости в случае вытянутых эллипсоидов вращения гораздо больше
соответствующих значений для сплющенных эллипсоидов2*. Довольно надежные
оценки молекулярных масс можно получать на основе параллельных измерений
седиментации и вязкости. При измерении вязкости в растворах, содержащих
очень длинные молекулы, получаемые значения весьма заметно зависят от
величины градиента скорости (скорости сдвига) в измерительном приборе. За
счет сдвиговых напряжений может происходить обратимое изменение средней
конформации цепей больших ДНК. Этот эффект лежит в основе измерений
молекулярных масс методом упруговязкой релаксации.
Информацию о размерах и форме молекул можно получить также, измеряя
некоторые характеристики, связанные с их вращательным движением. При
одном подходе стараются найти анизотропное равновесное распределение
молекул по ориентациям, установившееся под действием какой-либо внешней
силы. Обычно в качестве таких сил, под действием которых возникает
анизотропное распределение, выступают сдвигающие усилия или электрические
поля. Используя другой подход, стараются проследить кинетику исчезновения
такого распределения, наблюдаемую при обратном его переходе в состояние
изотропного раствора с момента отключения внешней силы. Для регистрации
анизотропного распределения, в частности, используют два метода: линейный
дихроизм и двойное лучепреломление.
Гель-хроматография - простой, но чрезвычайно эффективный метод,
позволяющий определять размеры молекул, а также фракционировать молекулы
на основе различий в размерах. Молекула, которая не может проникать в
поры молекулярного сита, движется быстрее вдоль колонки, чем молекула
меньших размеров. Еще одним чрезвычайно полезным инструментом,
применяемым для очистки и качественного анализа смесей макромолекул,
служит электрофорез. Довольно трудно получить аналитическое выражение,
связывающее наблюдаемую в опыте электрофоретическую подвижность с зарядом
и формой молекулы. Однако в некоторых специальных случаях электрофорез
дает количественную информацию. Пользуясь методом изоэлектрического
фокусирования, находят pH изо-электрических точек белков. А
воспользовавшись электрофорезом в носителе, представляющем собой
молекулярное сито, можно крайне просто определять молекулярную массу
белков (в присутствии ДСН) или нуклеиновых кислот.
11 В пересчете на единицу концентрации последних. - Прим. ред. 21 При
одной и той же величине отношения осей. - Прим. ред.
ДРУГИЕ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
307
Задачи
12.1. В каждый их трех сосудов помещают одинаковое количество смолы,
используемой в качестве молекулярного сита. Добавляют растворитель в
количестве, достаточном для того, чтобы поверх зерен геля образовался еще
некоторый свободный от геля верхний слой. В первый сосуд добавляют 7VB
молей белка, во второй - Л/л молей молекул низкомолекулярного вещества
(лиганда), в третий - и то и другое вместе. После того как все приходит в
равновесие, в верхнем слое измеряют концентрации лиганда и белка.
Покажите, что можно рассчитать среднее число связанных лигандов,
приходящееся на одну молекулу белка. Можете считать, что белок и все
комплексы белка с лигандом совершенно не проникают внутрь геля, в то
время как для свободных молекул лиганда доступен весь объем внутренних
областей геля.
12.2. Найдите коэффициент гидратации вируса табачной мозаики, если
измерения характеристической вязкости дают величину [jj] = 37 см3/г и
известно, что отношение осей составляет 18:1 (случай вытянутого
эллипсоида). Можете считать, что значение парциального удельного объема
близко к нижнему пределу области, характерной для белков, поскольку вирус
более чем на 90% по весу состоит из белка.
12.3. Белок может существовать в двух формах, мономерной и димерной.
Мономер представляет собой сплющенный эллипсоид вращения, но надежные
измерения его отношения осей не проводились. Коэффициент диффузии
мономера в 1,96 раза больше коэффициента диффузии димера.
Характеристическая вязкость димера в 6,45 раза превышает соответствующее
значение для мономера. Каково отношение осей у димера? Можете считать,
что (а) значение парциального удельного объема у мономера и димера одно и
