Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
в уравнение
dc,'dt = Цд2с/су2) (12.63)
Начальным условиям отвечает такое состояние, при котором зона имеет
бесконечно резкую границу и расположена в верхней части колонки (х = 0) в
момент времени t = 0. Таким образом, у = 0 при / = 0, и исходную зону
можно представить дельта-функцией: с (у, 0) = н^(О), где Wq - масса
содержащегося в зоне растворенного вещества1*. Мы уже решали это
уравнение при точно таких же начальных условиях; воспользовавшись
решением, приведенным в Дополнении 10.2, получим
с(>>, t) = (и'0 чЧлLt) ехр( - v2,/4Lr) (12.64)
Теперь для того, чтобы можно было проводить сравнение с экспериментом,
сделаем обратную замену переменных (у = х - Fvt/%A), заменим t на V/Fv
(где V-полный объем жидкости, прошедший через колонку) и исключим х,
пользуясь тем обстоятельством, что измерения обычно проводят на выходе
колонки, где х = / = V3/?A [уравнение
(12.60)]. Далее выразим концентрацию растворенного вещества, элюируемого
из колонки, как функцию объемной скорости элюции Fv и объема элюата V:
c(Fy, V) = (vv0/^A^jAnLVjFy,) ехр[- Fv( Уэ~ V)2/4?M2LK] (12.65)
Формула (12.65) показывает, что при постоянной скорости элюции эпюционный
про филь c(Fv, V) на выходе колонки для гель-хроматографии не имеет вида
простой гауссовой зависимости от объема V элюата.
Часто приходится встречать высказывания, смысл которых заключается в том,
что элюируемая зона представляет собой единственный гауссов пик, и
поэтому данный материал является гомогенным веществом. Из вышеизложенного
ясно, что такое утверждение неверно. В самой колонке, однако, профиль
зоны с растворенным веществом в любой фиксированный момент времени t
имеет вид простой гауссовой зависимости по у, а следовательно, и по х.
Экерс (Ackers, 1975) разработал изящные методические приемы, позволяющие
непосредственно путем сканирования регистрировать распределение
растворенного вещества в колонках с гелем. С помощью этой методики легко
определяется коэффициент L, и, что еще важнее, при этом упрощается
количественный анализ смесей растворенных веществ или систем, не
достигших равновесия.
** с здесь и в формуле (12.64) имеет размерность: масса/длина. - Прим.
ред.
298
ГЛАВА 12
СВОЙСТВА МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИТ В СВЯЗИ С РАЗМЕРАМИ И КОНФОРМАЦИЕЙ МАКРОМОЛЕКУЛ
Теперь остается связать о со свойствами макромолекулярных компонентов
раствора. Из уравнений, которые мы вывели ранее, можно видеть, что все
три величины - а, ? и Уэ - равноценны [см. уравнения (12.58) и (12.60)].
Если бы все поры в геле имели одинаковые размеры, то а должен был бы
представлять собой ступенчатую функцию, равную единице для молекул,
размеры которых меньше размеров пор, и равную нулю для молекул, размеры
которых превышают размеры пор. Если же имеется некоторое распределение
пор по размерам, то наблюдается некая плавная зависимость а от размера
молекул. Не следует забывать, что величина коэффициента распределения для
макромолекулы определяется именно ее размерами, а не массой. Конечно, для
молекул одинаковой формы размеры являются функцией молекулярной массы.
Многие исследователи показали, что существует корреляция между а и
молекулярной массой. При хроматографии разных белков на определенном геле
c=-A\gM + B (12.66а)
где А н В - константы. Рис. 12.16 иллюстрирует такую корреляцию. Для
многих молекул соответствующие точки хорошо ложатся на кривую
предсказываемой зависимости, но некоторые явно выпадают из нее.
Более тщательный анализ приводит к зависимости вида
о= -A 'lg ггидр + В' (12.666)
,0
1,5
,0 <
ьГ
1,5
1,0
10" 105 106
Молекулярная масса
РИС. 12.16. Объем элюирования различных белков на колонке, для набивки
которой использовался сефадекс G-200, как функция молекулярной массы
белка. По вертикальной оси справа отложена величина отношения объемов
элюирования соответственно белка и голубого декстрана
(высокомолекулярного полисахарида, который, как полагают, не проникает
внутрь геля). [Andrews, Biochem. J., 96, 595 (1965).]
ДРУГИЕ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
299
где лгвдр - эффективный радиус гидратированной молекулы. Это та самая
величина, которая получалась бы из диффузионных измерений, если бы мы,
никак не учитывая форму молекулы, просто формально применили бы закон
Стокса: kT/D = / = 6irчггидр- Формула (12.666) лучше согласуется с
экспериментальными данными, чем формула (12.66а). Поэтому при наличии
достаточно надежного способа калибровки, позволяющего определить
коэффициенты А' и В', распределительную гель-хроматографию можно
использовать для измерения коэффициента трения макромолекулы. Поскольку
посредством гель-хроматографии находят ггидр, в ряде случаев полагают,
что этот метод эквивалентен диффузионным измерениям. Результаты,
полученные с помощью гель-хроматографии, можно скомбинировать с
измерениями коэффициента седиментации, что позволяет определять
молекулярную массу.
Можно показать, что для смесей молекул наблюдаемый в опыте коэффициент о
представляет собой средневесовое значение по всем растворенным
