Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кантон Ч. -> "Биофизическая химия. Том 2" -> 154

Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.

Кантон Ч., Шиммер П. Биофизическая химия. Том 2 — М.: Мир, 1984. — 496 c.
Скачать (прямая ссылка): biofizicheskayahimiya1984.djvu
Предыдущая << 1 .. 148 149 150 151 152 153 < 154 > 155 156 157 158 159 160 .. 242 >> Следующая

функции pH позволяет найти изоэлектрическую точку молекулы. Это такое
значение pH, при котором средний суммарный заряд частицы равен нулю.
Подвижность в изоэлектрической точке также равна иулю. Более того,
частица движется к катоду, если pH меньше значения, соответствующего ее
изоэлектрической точке, или в противоположную сторону, если pH больше
этого значения.
Было бы утомительно проводить серию электрофоретических опытов при
различных близких друг к другу значениях pH. Разумной альтернативой такой
постановки опыта служит электрофорез в градиенте pH. Этот вариант метода,
называемый изоэлектриче-ским фокусированием, является прямым аналогом
равновесного центрифугирования в градиенте плотности. Молекулы, несущие и
положительные и отрицательные заряды, называют амфолитами; к ним
относятся, например, полимеры, содержащие многочисленные амино- и
карбоксильные группы. Смесь амфолитов с широким спектром изоэлек-
трических точек вводят в колонку и ожидают, пока она не распределится по
колонке под действием электрического поля. Таким способом достигается
стабилизация градиента pH, в котором каждый конкретный амфолит
оказывается около своей изоэлектрической точки. Для того чтобы избежать
потерь биологического материала на аноде или катоде, на обоих концах
градиента устанавливают такие значения pH, при которых у биологических
материалов не может быть изоэлектрических точек. Чтобы подавить
конвекцию, градиент pH создают в твердотельном носителе. В эту систему
добавляют небольшое количество белка. Он мигрирует, пока не достигнет pH,
соответствующего его изоэлектрической точке. Там он и концентрируется,
образуя узкую зону. Чтобы проанализировать результаты такого опыта, можно
просканировать гель и измерить поглощение белка; можно также окрасить
белок либо нарезать гель на тонкие слои и измерить в каждом слое pH,
содержание белка, ферментативную активность или радиоактивность.
ДРУГИЕ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
303
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА НАТРИЯ КАК МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС
Второй, очень популярный, метод - это зональный электрофорез в
присутствии доде-цилсульфата натрия (ДСН). Здесь основная идея состоит в
том, чтобы превратить все белки в молекулы со сходной структурой, которые
отличались бы друг от друга лишь значениями молекулярной массы. ДСН -
сильный денатурирующий агент по отношению к белку. Он связывается со
всеми белками в первом приближении одинаково: примерно 1,4 г на 1 г
аминокислот. Каждая молекула ДСН несет один отрицательный заряд.
Благодаря такому количеству ДСН в комплексе ДСН-белок общая плотность
зарядов в комплексе более или менее одинакова для самых разных белков,
несмотря на вариации в величине заряда последних. В систему добавляют
восстанавливающие агенты, такие как 0-меркаптоэтанол, для того чтобы
разорвать все дисульфидные мостики - как внутри цепей, так и между
разными цепями. В этих условиях уже ничто не мешает молекулам белка после
денатурации находиться в тех равновесных формах, которые обусловлены
взаимодействиями в комплексе ДСН-белок. Изучением структуры ДСН-белковых
комплексов занимались Тэнфорд с сотрудниками. Гидродинамические измерения
показали, что эти комплексы представляют собой вытянутые эллипсоиды или
стержни постоянно го сечения, диаметр которых составляет примерно 18 А, а
длина и молекулярная масса связаны линейной зависимостью.
В качестве носителя при электрофорезе в присутствии ДСН обычно применяют
полиакриламидные гели. Эти гели можно приготовить при различных значениях
отношения
^ Концентрация геля, 97о ^ Подвижность
РИС. 12 18 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии ДСН.
А. Относительная подвижность семи различных белков как функция
концентрации акриламидного геля Значения молекулярных масс белков лежат в
диапазоне от 14 ООО для белка оболочки бактериофага R17 (кривая 7) до 60
ООО для каталазы (кривая 1). Я. Относительная подвижность различных
белков в 10% акрила-мндных гелях как функция молекулярный массы. (Weber
К., Osborn М., 1975.)
304
ГЛАВА 12
сухой массы геля к массе растворителя. Практика показывает, что чем
больше концентрация геля, тем меньше величина кажущейся
электрофоретической подвижности. Если аккуратно выполнить измерения, то
мы получим удивительный результат (рис. 12.18, А). Для целого ряда
однотипных белков подвижности, экстраполированные к нулевой концентрации
геля, совпадают. Результаты измерений можно описать зависимостью вида
In м(С) = - кхС + In и(0) (12.74)
где и(С) - величина кажущейся подвижности при концентрации геля С (в
процентах), кх - коэффициент, зависящий от концентрации сшивок в матрице
геля, а также от формы и молекулярной массы соответствующего белка, а
и(0) - величина, постоянная для некоторой группы однотипных молекул.
Подвижность при нулевой концентрации геля должна отвечать истинной
электрофоретической подвижности ДСН-белковых комплексов, на которой не
сказываются никакие взаимодействия с гелем. Упрощенной теории
Предыдущая << 1 .. 148 149 150 151 152 153 < 154 > 155 156 157 158 159 160 .. 242 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed