Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
где Х^ха) - функция, протабулированная Генри (Rice, Nagasawa, 1961).
Однако во внешнем поле, за счет происходящих в нем движений макроиона и
малых ионов, ионное облако деформируется (рис. 12.17). В результате
потенциал нельзя описать формулой (12.70). Учет всех этих эффектов
представляет собой очень трудную задачу. В результате таких расчетов
получается формула, содержащая помимо главного члена, выражаемого
формулой (12.73), еще много дополнительных членов. Наиболее
удовлетворительно эта задача рассмотрена Бутом (более подробно об этом
см. Rice, Nagasawa, 1961). Согласно упрошенной теории, которая приводит к
формуле (12.73), подвижность макроиона прямо пропорциональна его заряду.
Более полные теории показывают, что при достаточно больших z подвижность
будет меньше того значения, которое предсказывает формула (12.73), и
может даже убывать при возрастании г.
Теория Бута, несмотря на всю ее сложность, не в состоянии
удовлетворительно объяснить экспериментальные данные по электрофорезу
макромолекул. Она хорошо описывает лишь случай равномерно заряженной
сферы, а такая модель является очень плохим представлением белка или
нуклеиновой кислоты. Вообразите эллипсоид с асимметричным распределением
зарядов по объему. Электрическое поле вызовет появление на нем вращающего
момента и перемещение его как целого. При этом возникнет преимущественная
ориентация, и движение макромолекулы уже не сможет более описываться
средним по всем ориентациям значением коэффициента трения. Более того,
все эти эффекты влияют на характер распределения зарядов в ионном облаке.
ПРИМЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА .
Несмотря на все перечисленные трудности, электрофорез является
действенным и удобным средством анализа и разделения белков и нуклеиновых
кислот, если не требовать от него количественных данных о структуре
молекул. Все теории предсказывают в полном согласии, что подвижность
прямо пропорциональна отношению суммарного заряда к коэффициенту трения.
Такая зависимость позволяет использовать электрофорез для получения
информации об относительной величине заряда (для молекул, которые имеют
одинаковые размеры и форму) или об относительных размерах (для молекул с
одинаковыми зарядами). Наиболее распространено применение электрофореза
для разделения и качественного анализа смесей молекул, опирающееся на
различия в размерах и форме отдельных компонентов.
При электрофорезе с движущейся границей (или свободном электрофорезе) к
толстому слою раствора макромолекул прикладывают электрическое поле и
регистрируют общее перемещение макромолекул в этом слое. В результате
электрофореза макромолекулы движутся как одна широкая зона, в результате
диффузии происходит размывание ее границы. Этот тип электрофореза легче
всего поддается математическому описанию. За процессом разделения можно
следить с помощью прямых оптических методов регистрации, как в случае
диффузии или седиментации. Однако как препаративный метод электрофорез с
движущейся границей не очень удобен, поскольку, как и при скоростной
седиментации, здесь разделение происходит фактически только на границе
зоны. Различные артефакты.
302
конвекция, экспериментальные трудности и эффекты многокомпонентности
снижают его ценность как общего аналитического метода.
Эти проблемы можно свести к минимуму при зональном электрофорезе, где
(как и в методе зонального центрифугирования) макромолекулы присутствуют
вначале лишь в очень тонком слое. Конвекцию можно подавить с помощью
градиента плотности, но гораздо большее распространение получил
электрофорез в твердотельном носителе, насыщенном буфером. Некоторые
носители лишь слабо или неспецифически реагируют с ма-кромолекулярными
компонентами раствора; к ним относятся бумага, целлюлоза для тонкослойной
хроматографии и ацетат целлюлозы. В других материалах при движении
молекул происходит отставание молекул одних типов от молекул других
типов; к ним относятся полиакриламидные и агарозные гели (в которых
происходит сортировка молекул по размерам) и бумажные ионообменники (в
которых осуществляется избирательная задержка заряженных молекул).
При наличии твердотельного носителя количественный анализ результатов
измерения подвижности становится почти невозможным. Ко всем
вышеупомянутым трудностям прибавляется еще то обстоятельство, что
молекуле приходится следовать по извилистой траектории в теле носителя. В
результате трудно установить корреляцию между наблюдаемой в опыте
результирующей подвижностью и фактической подвижностью молекул. Еще
больше осложняют дело те или иные особенности взаимодействия с
поверхностью носителя, такие, например, как установление равновесия между
связанным и свободным состояниями растворенного вещества.
Существуют, однако, две разновидности зонального электрофореза, которые
могут дать некоторую количественную информацию о молекулах. В основе
одной из них лежит тот факт, что величина заряда белка или иной
макромолекулы зависит от pH. Изучение электрофоретической подвижности как
