Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
первую очередь потому, что позволяет диагностировать порфириновые
болезни. Поэтому в большинстве опубликованных работ, посвященных
разделению порфиринов методом ВЭЖХ, описано клиническое применение
метода. Состав порфиринов в различных видах биологических материалов
различен. Для выявления порфириновых заболеваний наиболее целесообразно
определять содержание порфиринов - от уропор-фирина до копропорфирина и
изокопропорфирина в моче пациентов. При анализе кала кроме перечисленных
соединений следует также определять дикарбоксипорфирины, главным образом
протопорфирин и его метаболиты (мезо- и дейтеропорфи-рин)-они образуются
в качестве продуктов метаболизма под действием бактерий в прямой кишке.
Цинк-протопорфирин был обнаружен среди порфиринов эритроцитов. Поэтому
методики ВЭЖХ, применяемые в клинических лабораториях, должны позволять
проводить разделение и идентификацию всех перечисленных порфиринов.
Разделение порфиринов при помощи ВЭЖХ осуществляется также с целью
исследования биосинтеза порфиринов - как синтетических, так и выделенных
из биологических материалов.
Разделение порфиринов можно проводить, используя свободные
порфиринкарбоновые кислоты или их эфиры. Даже в на-
Порфирины 501
• стоящее время во многих лабораториях для разделения эфиров порфиринов
методом ВЭЖХ используются колонки, заполненные полярным силикагелем.
Однако для разделения свободных порфиринов вполне пригодны обращенные
фазы, получившие в настоящее время столь широкое распространение.
10.3.1. Разделение эфиров порфиринов
В начале 70-х годов в качестве неподвижной фазы в ВЭЖХ применялся
силикагель и разделение осуществлялось по механизму адсорбционной
хроматографии. Таким образом, методики, разработанные для разделения
эфиров порфиринов методом ТСХ, легко было приспособить для ВЭЖХ.
Некоторые из методов разделения, разработанных в то время, представляют
сейчас лишь исторический интерес, поскольку используемые в них
оборудование и материалы устарели. В 1975 г. несколько научных групп
опубликовали разработанные независимо друг от друга методы ВЭЖХ,
позволяющие проводить качественный и количественный анализы эфиров
порфиринов в тканях и биологических жидкостях человека [15, 28, 37, 52-
54].
10.3.1.1. Программирование объемной скорости. Для исследования
порфиринов из различных природных источников Эванс и др. [15, 53]
использовали ВЭЖХ в сочетании с масс-спектро-метрией. Эфиры порфиринов
разделяли на ВЭЖХ-колонках, заполненных поверхностно-пористым (корасил
II) или тонкодисперсным (лихросорб SI60, 10 мкм) силигателем. В качестве
элюента для колонок с корасилом была выбрана смесь бензин/этил ацетат
(55:45). После завершения элюирования пор-фиринпентакарбоновой кислоты
объемную скорость увеличивали (стартовое значение 1 мл/мин), чтобы
ускорить элюирование более полярных соединений и уменьшить ширину пиков.
Однако чувствительность обнаружения при этом снижалась, более того, время
удерживания метилового эфира уропорфирина составляло 26 мин, а пик был
относительно широким.
Авторы работы [25] предложили разделять стандартные смеси порфиринов
на колонке (30X0,4 см) с ц,-порасилом при элюировании смесью
бензол/этилацетат/хлороформ (7:1:2) с программируемым увеличением
объемной скорости от 2 до 3 мл/мин после выхода эфира
порфиринпентакарбоновой кислоты. Несмотря на то что элюирование более
полярных соединений велось при большей объемной скорости, у пика
метилового эфира уропорфирина наблюдался заметный хвост.
10.3.1.2. Градиентное элюирование. Авторы работы [37, 52] изучали
состав смеси метиловых эфиров порфиринов, выделенных из мочи и кала. С
этой целью они использовали колонки
502 Глава 10
(60X0,3 см), заполненные различными неподвижными фазами, в частности
корасилом II и порасилом Т. На пооследней были успешно разделены смеси
порфиринов, содержащих от 2 до 8 эфирных групп. Элюирование велось в
градиентном режиме: от смеси бензин/метилендихлорид (40:100) плюс 0,1%
триэтил-амина до смеси бензин/метилендихлорид/н-пропанол (15:100: :50).
Градиент создавался в результате того, что менее полярный растворитель
помещался в петлю между насосом и колонкой. При объемной скорости 1
мл/мин более полярная смесь достигала колонки через 12 мин.
Пытаясь улучшить разделение, достигнутое при программировании объемной
скорости, Эванс и др. [15, 21] обратились к методике градиентного
элюирования и провели хроматографирование на колонке (60X0,3 см) с
лихросорбом SI 60. Время удерживания изменялось от 4 мин для эфира
протопорфирина до примерно 20 мин для эфира уропорфирина.
На полученной хроматограмме наблюдалось несколько широких пиков с
максимумом поглощения. Элюирование велось в экспоненциальном градиентном
режиме при объемной скорости
3 мл/мин от гексана до 70%-ного этилацетата в гексане. Отдельные
компоненты элюента смешивались в стеклянной смесительной камере,
устройство которой подробно описано в работе [21]. В результате
