Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
используется для определения концентрации порфиринов.
10.2. Методы подготовки проб
При выборе методики анализа порфиринов необходимо учитывать, с какой
целью он проводится. Рутинный метод должен быть максимально простым и
быстрым и должен давать воспроизводимые и достоверные данные. Поскольку
ВЭЖХ - высокочувствительный и достоверный метод, большое значение
приобретают способы подготовки проб к хроматографическому анализу. Методы
предварительной обработки включают, как правило, такие стадии, где
точность проводимых измерений значительно ниже, чем у собственно
хроматографического метода, что снижает точность конечных результатов.
Степень сложности методов подготовки биологических проб для
хроматографического разделения обусловлена их природой. Выбор метода
хроматографического разделения определяет характер подготовки образца к
анализу. Порфирины можно разделять и анализировать в виде эфиров, как
правило метиловых, либо непосредственно в виде природных свободных
порфиринкарбоновых кислот.
Чтобы избежать разложения порфиринов, все операции с
порфиринсодержащими образцами необходимо проводить в темноте или при
освещении красным светом.
Наиболее распространенные методы подготовки проб обсуждаются в начале
соответствующих разделов.
10.2.1. Моча
10.2.1.1. Эфиры порфиринов. Процедура подготовки проб включает три
стадии: выделение, этерификацию и концентрирование.
Эфиры _ порфиринов, в основном метиловые, отличаются большей
растворимостью в органических растворителях, чем свободные порфирины, что
облегчает их экстракцию из биологических материалов. Схема, приведенная
на рис. 10.3, отражает наиболее широко распространенный метод подготовки
к анализу проб мочи и кала [18-20].
Адсорбция на тальке. К аликвотному объему пробы мочи, pH которой
предварительно доводят до 4, добавляют навеску талька (рис. 10.3). Смесь
перемешивают и фильтруют. Фильтрат, из которого порфирины должны быть
удалены адсорбцией на тальке, проверяют на остаточную флуоресценцию в
красной области. И если таковая обнаружена, а это означает, что в мо-
Порфирины 495
0.5 влажного кала 2 мл мочи
I i
Высушивают лнофилизацией Добавляют СНзСООН до pH 4
\ ^
Смешивают с 5% H2S04/CH30H Добавляют 0,5 г талька и
перемеши-
(10 мл) вают 15 мин
I J
Кипятят с обратным холодильни- Фильтруют и фильтрат
выбрасыва-
ком на водяной бане 10 мин ют (проверив в конце на красную
флуоресценцию)
I
Остаток после
фильтрования смешивают с 5% H2SO4/CH3OH
1
Центрифугируют 1
Промывают осадок 5% (15 мл)
H0SO4/CH3OH (3 мл) 1
Кипятят с обратным холодильником
Центрифугируют на ВОдяной бане 10 мин
т t
Экстракты объединяют Фильтруют, промывают остаток 5%
H2SO4/CH3OH (3 мл)
1
Экстракты объединяют 4 1 '¦ 1
" " -•*
\
Добавляют насыщ. СНзСОСЖа до pH 3,5
I
Добавляют воду до полного растворения осадк?
I
Экстрагируют СНС13 (25 мл)
I
Промывают водой (2X50 мл)
1
Высушивают Na2S04
I
Выпаривают
1
Растворяют в 0,5 мл СНС1з \
ВЭЖХ-анализ
Рис. 10.3. Схема выделения и этерификацин порфиринов мочн и кала.
че остались значительные количества порфиринов, проводят дополнительную
обработку тальком (см. схему на рис. 10.3).
Экстракция растворителями. Другой метод выделения порфиринов-
экстракция их органическими растворителями из мочи, pH которой доведен до
3,0 концентрированной соляной кислотой [8, 21]. На первой стадии
экстракцию проводят смесью этил-ацетат/н-бутанол (I г 1). Далее несколько
раз экстрагируют
496 Глава 10
пробу к-бутанолом, пока в органической фазе не перестанет обнаруживаться
