Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 212

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 206 207 208 209 210 211 < 212 > 213 214 215 216 217 218 .. 296 >> Следующая

было гораздо меньше, чем при разделении на колонке с ц.-бондапаком, что
демонстрирует хроматограмма, приведенная на рис. 10.13.
Кровь. Авторы работы [41] описали разделение порфиринов, содержащихся
в образцах цельной крови, методом ион-парной ВЭЖХ на колонке с обращенной
фазой (ц.-бондапак Ci8). Элюентом служила смесь 50 мМ водного раствора
гидроксида тетрабутиламмония, значение pH было доведено до 7,5 фосфорной
кислотой с ацетонитрилом (34:66). Объемная скорость составляла 2 мл/мин.
Обнаружение осуществляли при помощи детектора по флуоресценции (длина
волны возбуждения 400 нм, испускания >560 нм). Пробы крови вводили
непосредственно после гемолиза эритроцитов на предколонку, заполненную
поверхностно-пористой неподвижной фазой Cis- Внутренним стандартом служил
октаметиловый эфир уропорфирина, который растворяли в лизирующем
реагенте.
Хроматографический анализ состава нормальной крови показал, что среди
порфиринов преобладает цинк-протопорфирин IX, который хорошо отделяется
от протопорфирина IX (рис. 10.14).
Другие материалы. Используя в принципе такую же систему, которая была
применена для разделения мочи, лишь заменив спирт, авторы работы [31]
смогли разделить смеси синтети-
Порфирины 513
ческих и природных порфиринов. Проведение методом ВЭЖХ разделения
порфиринов, содержащихся в экстрактах глубоководных морских медуз,
показало, что основной его компонент - протопорфирин. Элюирование в
данном случае велось смесью этанол/вода (17:3). Элюирование смесью
метанол/вода (85: 15) позволило разделить компоненты смеси
"гематопорфириновых производных" фоточувствительных соединений,
применяемых в клинических исследованиях раковых заболеваний [65].
10.3.2.2. Другие примеры разделения на обращенных фазах. Моча. В 1979
г. авторы работы [34] предложили методику определения свободных
порфиринов в моче при помощи ВЭЖХ. Согласно этой методике, разделение
проводилось с использованием системы из двух колонок - предколонки
(5x0,46 см) с обращенной фазой и основной колонки с ц-бондапаком С]8. На
предколонке порфирины отделялись от других флуоресцирующих
(непорфириновых соединений): порфирины улавливались, а все прочие
соединения элюировались, после чего порфирины поступали на основную
колонку, где и осуществлялось их разделение. Подкисленную пробу мочи
наносили на предколонку и элюировали пробу сначала 15%-ным раствором
ацетонитрила в 0,01 М фосфатной кислоте и далее только фосфорной
кислотой. После этого предколонку уравновешивали 10 мМ фосфатным буфером
(pH 7,5) до того момента, пока pH элюента на выходе из колонки не
достигал 6. После этого предколонку соединяли с основной колонкой и
проводили на последней разделение при градиентном элюировании
ацетонитрилом в фосфатном буфере (от 0 до 50% ацетонитрила в течение 30
мин). Объемная скорость во всех случаях составляла 1 мл/мин. Разделение
проб, содержащих серии порфиринов от уро- до коп-ропорфирина, было
достаточно эффективным- разделялись даже изомеры копропорфирина I и III.
Для обнаружения использовался детектор по флуоресценции (длина волны
возбуждения 400 нм, испускания 650 нм). Следует отметить, однако, что
данный метод разделения довольно сложен и трудоемок, он требует
применения нескольких элюентов, точности в переключении потока, а
длительность анализа составляет более 100 мин.
Та же группа исследователей с успехом провела скоростное разделение
синтетической смеси изомеров свободного уропорфи-рина на том же
оборудовании [66]. Порфирины адсорбировались на предколонке по методу,
описанному в работе [34]. Если элюентом служит 4%-ный раствор
ацетонитрила в 10 мМ фосфатном буферном растворе (pH 6,5), то изомеры I-
IV можно разделить при элюировании со скоростью 0,9 мл/мин (рис. 10.15).
Однако изомеры II и IV в этих условиях разделяются лишь отчасти.
Разделить содержащиеся в образцах мочи уропорфирины I и III можно,
увеличивая концентрацию ацето-
33-1489
514 Глава 10
Рис. 10.15. Хроматограмма синтетической смеси изомеров 1-IV свободного
уро-порфнрина [66].
t, мин
нитрила до 5% и повышая объемную скорость до 1 мл/мнн. Менее чем за 15
мин в указанных условиях удалось получить хорошо разрешенные (почти до
нулевой линии) пики изомеров.
Боммер [67] модифицировал метод Вайана и др. [86] и применил его для
рутинного хроматографического разделения изомеров I и III уропорфирина.
Хроматографирование проводилось на колонке с ц-бондапаком при элюировании
5%-ным раствором ацетонитрила в 10 мМ растворе фосфата натрия (pH 6,85) с
объемной скоростью 1 мл/мин. Все изомеры при хорошем разрешении
элюировались в течение 10 мин (рис. 10.16).
Для выделения свободных порфиринов мочи авторы работы
[35] использовали колонки с обращенными фазами (колонка, заполненная ц-
бондапаком С](r) и предколонка размером 2,3X Х0,4 см). Элюирование
проводили в градиентном режиме, повышая концентрацию метанола в 0,1 М
фосфатном буферном растворе (pH 3,5) от 55 до 100% при объемной скорости
Предыдущая << 1 .. 206 207 208 209 210 211 < 212 > 213 214 215 216 217 218 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed