Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
492 Глава 10
измерения. Методы фракционирования и количественного определения уро- и
копропорфирина мочи были разработаны Ри-мингстоном и др. [3].
Усовершенствованные их варианты [4, 5] находят применение и в настоящее
время. В 1945 г. Гринштейн и др. [6] начали адсорбировать порфирины на
тальке, что, как выяснилось, оказало существенное влияние на дальнейшее
их исследование.
В разработанном Визом [7] методе тонкослойной хроматографии порфиринов
используется эта их способность. Метод разделения производных порфиринов,
в основном их метиловых эфиров, на пластинках с силикагелем [8, 9] до сих
пор один из самых распространенных методов разделения этих соединений, по
крайней мере к нему прибегают во многих лабораториях. Колоночная и
бумажная хроматография применяется для исследований порфиринов больных
порфирией с 1969 г. [10]. Электрофорез [И] и противоточная экстракция
[12] используются для выделения порфиринов из биологических объектов. В
последние годы исследование порфиринов и металлопорфиринов ведется также
такими современными аналитическими методами, как спектрофотометрия (их
производных) [13], ядерный магнитный резонанс [14], масс-спектрометрия
[15].
10.1.3. Химические и физико-химические свойства
10.1.3.1. Растворимость. Боковые кислотные группы придают порфиринам
свойства амфолитов и, следовательно, способность растворяться и в
кислотах, и в основаниях. Порфирины хуже всего растворяются в таких
водных растворах, pH которых близок к четырем, причем растворимость
зависит от значения изо-электрической точки индивидуальных порфиринов, и
легко экстрагируются органическими растворителями. С помощью разбавленных
растворов минеральных кислот осуществляют реэкстракцию порфиринов из их
растворов в эфире или этил-ацетате. В самом начале XX в. Вильштеттер и
Фишер [16] разработали метод фракционирования порфиринов из растворов в
эфире путем их обработки растворами НС1 увеличивающейся концентрации.
Порфирины, имеющие большее число кислотных групп, менее растворимы в
органических растворителях: уро-порфирин, например, совсем нерастворим в
эфире. Металлоком-плексы порфиринов нерастворимы в водных растворах
кислот, поскольку не могут существовать в форме катионов. Под действием
сильных минеральных кислот металлопорфирины теряют центральный ион
металла и превращаются в дикатионы. Порфирины с ненасыщенными боковыми
группами лучше растворимы в органических растворителях, чем их насыщенные
аналоги. Поэтому мезопорфирин, имеющий две этильные боковые группы,
Порфирины 493
Таблица 10.1. Длины волн, соответствующие максимумам возбуждения (полосы
Соре) и испускания флуоресценции порфиринами в различных растворителях
[41, 43]
Порфирин Раство Возбужде Испуска
ритель3 ние, нм ние. нм
Уропорфирин А 398 618
Б 405 598
Копропорфирин А 392 615
Б 400 589
Протопорфирин IX А 400 626
Б 408 604
Zn-Протопорфирин А 414 586
Октаметиловый эфир А 398 578
\'ропорфирина
а А - 50 мМ тетрабутила ммонийфосфат в воде (pH 7,5)/аце-тонитрнл
(34:66), Б - 1,5 мМ соляная кислота.
в меньшей степени экстрагируется из водных растворов, чем протопорфирии,
имеющий две винильные группы.
10.1.3.2. Спектроскопия. Спектроскопические свойства порфиринов
обусловлены тем, что их молекула планарна и что одинарные связи
чередуются с двойными. Порфирины имеют специфические спектры поглощения и
флуоресценции, что облегчает их обнаружение.
Поглощение в УФ- и видимой областях спектра. В 1883 г. Соре [17]
показал, что характеристический спектр поглощения порфиринов имеет четкую
интенсивную полосу в области, близкой к ультрафиолетовой (а также
несколько полос в видимой области). Длины волн, соответствующие полосам
Соре, и их молярные коэффициенты поглощения зависят от природы боковых
групп порфиринов и от применяемого растворителя (табл. 10.1). Наиболее
высокие (5-105 л/(моль-см)) молярные коэффициенты поглощения наблюдаются
у ряда порфириновых дикатионов.
Флуоресценция. Облучение порфиринов в ближней УФ-области вызывает
интенсивную флуоресценцию в красной области, причем более интенсивную в
кислой среде, чем в нейтральной или щелочной. Изменение боковых цепей и
растворителя приводит к изменению положения полосы и интенсивности
испускания (табл. 10.1). Большинство металлопорфиринов, содержащихся в
биологических материалах, не способны к флуоресценции. Исключение
составляют Zn-комплексы. Батохромный сдвиг, наблюдаемый для этих
порфиринов, примерно равен наблюдаемому для свободных порфиринов (табл.
10.1). Поскольку флуо-
494 Глава 10
ресцентный метод характеризуется более высокой селективностью и
чувствительностью по сравнению со спектрофотометрическим, он широко
