Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
[60]. Для выделения трех фракций, содержащих изомеры I, III/IV и II,
необходимо провести два хроматографических цикла. Смесь изомеров III и IV
этерифи-
Порфирины 507
цировали и полученные метиловые эфиры хроматографировали на двух колонках
с порасилом при элюировании смесью эфир/ /гептаи (2:3) с объемной
скоростью 2 мл/мин. Для полного разделения компонентов понадобилось
осуществить 10-12 циклов. Обнаружение проводили при длине волны 380 нм.
В том же году другая группа ученых также провела успешное разделение
метиловых эфиров различных копропорфиринов [18, 26].
Проводя элюирование смесью этилацетат/циклогексан (4 : 6) при объемной
скорости 1,5 мл/мин, авторы работы [18] разделили на колонке с партисилом
метиловые эфиры копро- и изо-копропорфиринов. Пики на хроматограмме
достигали нулевой линии. Хроматографирование метилового эфира
копропорфири-на и метиловых эфиров диэтил- и изокопропорфиринов
осуществлялось на колонке с |д,-партисилом при элюировании смесью
метилацетат/изооктан (1:4).
Эфиры уропорфиринов. Большинство природных уропорфи-ринов относится к
типу изомера III. В нормальных условиях уропорфирин I присутствует в
биологических объектах только в микроколичествах. Однако при некоторых
определенных заболеваниях возможны образование и секреция значительного
количества уропорфирина I. В последние годы опубликовано несколько
методов разделения изомеров эфиров уропорфиринов [61-63].
Авторы работы [61] первыми применили ВЭЖХ для разделения изомеров I и
III. Они провели хроматографирование на двух колонках с ц-порасилом,
элюируя пробу смесью н-гептан/ /уксусная кислота/ацетон/вода (90 : 60 :
30 : 0,05) с объемной скоростью 1,5 мл/мин. Удовлетворительное разделение
достигалось после пяти циклов (рис. 10.8). Используя меченные 3Н (I) и
I4C (III) изомеры, эти авторы показали, что потери в процессе
хроматографирования составляют менее 2%.
В работе [62] описан модифицированный вариант рассмотренного выше
метода, согласно которому элюирование ведется смесью н-гептан/уксусная
кислота/ацетон (6:3:2). При объемной скорости 0,5 мл/мин почти полное
разделение изомеров I и III достигалась за один хроматографический цикл,
однако длился он почти 3 ч. Кроме того, необходимо было в течение
нескольких часов уравновешивать колонки элюентом, содержащим
дополнительно одну часть воды. При использовании этой же системы для
разделения всех четырех октаметиловых эфиров уропорфирина были выделены
три фракции, содержащие изомеры I, III/IV и II. Все попытки разделить
изомеры III и IV потерпели неудачу.
Относительно недавно опубликован метод разделения метиловых эфиров
уропорфиринов I и III, позволивший значительно (до 20 мин) сократить
длительность анализа [63]. Разделение
508 Глав-! 10
t, мин
Цикл 5 Цикл 4 ЦиклЗ Цикл 2 Цикл 1
Рис. 10.8. Разделение октаметиловых эфиров уропорфиринов I и III с
использованием нескольких хроматографических циклов.
проводится на колонке (25x0,5 см) с гиперсилом APS. Несмотря на
многочисленные попытки улучшить разделение путем модифицирования элюента
-• смеси гексан/этилацетат/бутанол/ /уксусная кислота (85:12:3:0,1),
полного разрешения пиков (до нулевой линии) достигнуть не удалось. Тем не
менее в диагностических целях метод можно считать вполне приемлемым.
10.3.2. Разделение свободных порфиринов
Все изложенные выше методы предполагают разделение порфиринов в виде их
эфиров, хотя природные порфирины имеют свободные карбоксильные группы.
Промежуточная стадия этерифи-кации хотя и достаточно проста, однако в
ряде случаев может порождать проблемы, такие, например, как неполная и
дифференцированная этерификация или взаимодействие этерифици-рующего
агента с винильными группами порфиринов. Более того, процедуры
этерификации и экстракции эфиров являются трудоемкими. Очевидно, что
разделение немодифицированных порфиринов (имеющих свободные карбоксильные
группы), содержащихся в биологических пробах, более предпочтительно.
Разделение в этом случае целесообразно проводить на обращенной фазе,
наиболее пригодной для хроматографирования полярных веществ и получившей
в настоящее время широкое распространение. Методы разделения свободных
порфиринов необходимо адаптировать с учетом специфики свойств конкретных
биологических материалов, в составе которых они находятся, так как эти
свойства оказывают значительное влияние на результаты разделения.
10.3.2.1. Ион-парная обращенно-фазовая хроматография.
Разделение методом ИПХ проводят при добавлении в элюент
Порфирины 509
(c)
10 15
t.MHH
20
t.MIUi
Рис. 10.9. Разделение порфириновых стандартов, растворенных в моче, при
помощи ион-парной хроматографии иа обращенной фазе.
Нумерация пиков соответствует числу карбоксильных групп в составе
порфиринов 41 и 4111 - копропорфирины I и 111.
Рис. 10.10. Разделение при помощи ион-париой хроматографии на обращенной
фазе свободных порфиринов мочи больных porphyria cutanea tarda. Нумерация
