Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
флуоресценция в красной области. После этого органическую фазу промывают
водой и упаривают досуха, остаток этерифицируют.
Предварительное разделение на полистироле. Авторы работы [22] проводят
предварительное разделение пробы на колонке с полистиролом (XAD-2). После
нанесения пробы колонку промывают 0,1 М НС1 и затем элюируют порфирины
2%-ной НС1 в ацетоне. После выпаривания растворителя сухой остаток
этерифицируют (см. следующий раздел). Выход порфиринов мочи составляет
80-100%.
Этерификация. Этерификация порфиринов мочи, адсорбированных на тальке,
проводится одним из следующих методов: 10-минутное кипячение в 5%-ном
растворе серной кислоты в метаноле [19] или 16-часовое выдерживание при
20°С в 10%-ном метанольном растворе серной кислоты. Для проб мочи с
высоким содержанием порфиринов допустима непосредственная этерификация
смесью серная кислота/метанол [18, 21], однако наличие следов воды может
препятствовать полной этерифика-ции [24]. Этерификацию проводят также
такими реагентами, как 5%-ный трифторид бора в метаноле [25, 26] или
диазометан [18] (последний используют реже).
Выходы. Обработка проб мочи описанными выше методами обеспечивает
выход порфиринов на уровне 75-80% [18]. В некоторых публикациях
сообщается о получении 100%-ного выхода порфиринов с насыщенными боковыми
цепями [27, 28]. Выход протопорфирина, содержащего винильные группы,
ниже, что обусловлено, по-видимому, его разложением (незначительным) в
процессе обработки пробы.
Количественный анализ эфиров порфиринов затрудняют неполная их
этерификация [18, 29] и образование смешанных ме-тил-этиловых эфиров
после обработки в среде хлороформа, стабилизированного этанолом [30].
10.2.1.2. Свободные порфирины. Для анализа свободных порфиринов мочи
при помощи ВЭЖХ предварительная обработка пробы практически не нужна, что
позволяет сэкономить время, затрачиваемое на этерификацию.
Пробы, предназначенные для разделения при помощи ИПХ. Аликвотную часть
пробы мочи, предназначенной для разделения методом ИПХ, можно вводить
непосредственно в хроматографическую колонку [31]. Однако авторы работ
[32, 33] предварительно фильтруют пробу, чтобы удалить из нее взвешенные
частицы, которые могут забить колонку.
Концентрация порфиринов в моче может быть чрезвычайно большой (>20
мг/л). Такие пробы следует разбавлять; разбавляют пробу обычно элюентом
[31, 33].
Порфирины 497
Пробы, предназначенные для разделения при помощи других методов.
Методы разделения, включающие "улавливание" порфиринов на предколонке
[34] или элюирование кислотными элюентами [35], требуют предварительного
подкисления пробы и ее центрифугирования.
Авторы работы [36] высушивали наибольшие количества мочи (50-100 мкл)
при 90 °С в слабом токе воздуха, а полученный остаток растворяли в
элюенте. Однако такая обработка может вызывать разложение некоторых
порфиринов.
10.2.2. Кал
Независимо от выбранного метода обработки пробу кала целесообразно
высушить, чтобы с ним легче было работать и чтобы ослабить его запах.
Полная дезодорация проб кала достигается лиофилизацией, после проведения
которой пробу диспергируют. Экстракция кала (50 мл/г) большим объемом
охлажденного льдом ацетона также позволяет получить сухой хрупкий остаток
[26], однако этот метод более трудоемок и сложен, чем первый.
10.2.2.1. Эфиры порфиринов. Непосредственная этерифика-ция. В
большинстве опубликованных работ порфирины кала этерифицируют без
предварительной экстракции [18, 20, 24]. Содержание порфиринов в кале
может быть большим, поэтому пробы обрабатывают этерифицирующим реагентом
несколько раз, одновременно осуществляется и экстракция. Обработку эфиров
порфиринов проводят до отрицательной реакции фильтрата по красной
флуоресценции [18] (рис. 10.3). Этерифициру-ющие реагенты и методика
этерификации приведены на схеме, показанной на рис. 10.3 (они практически
аналогичны методам обработки мочи).
Очистка порфириновой фракции. Дополнительная очистка,
предусматривающая разделение пробы на колонке с силикагелем, предложена
двумя различными группами исследователей [25, 37]. Авторы работы [25]
ввели ее с тем, чтобы удалить из пробы диетических продуктов пигменты.
Однако поскольку пигменты не мешают разделению порфиринов методом ВЭЖХ и
их последующему обнаружению при помощи современных методов, то проводить
предварительное отделение пигментов нецелесообразно. Авторы второй работы
[37] проводили предварительное разделение исходной смеси порфиринов на
две фракции, содержащие соответственно от прото- до уропропорфиринов и
"суб-уропротопорфирины". Вторая из фракций элюировалась после
уропорфирина и состояла в основном из неполностью этерифи-цированных
уропорфиринов [38].
32-1489
498 Глава 10
Рис. 10.4. Схема подготовки
пробы кала.
10.2.2.2. Свободные порфирины. Кал представляет собой сложную смесь,
из которой трудно количественно экстрагировать свободные
