Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
о содержащихся в эритроцитах
больных врожденной эритро-поэтической порфирией [19].
t. мин
Порфирины 505
t.MHH
Рис. 10.7. Хроматограмма метиловых эфиров порфиринов и их хелатов с
медью, содержащихся в экстракте кожи, после его 2-часового инкубирования
с ацетатом меди [45].
5 - уропорфирин; Т - порфнрингептакарбоковая кислота:
6 - порфирингексакарбоновая кислота; 5 - порфиринпен-1акарбоновая
кнслота; 4- копропорфирин (звездочками помечены пики хелатов меди).
эфиров порфиринов (или из хроматографической системы). Ионы меди(П)
образуют хелаты с порфиринами, имеющими небольшое число карбоксильных
групп. Комплексообразование наблюдалось уже через несколько часов. Анализ
порфиринов, содержащихся в пробах кожи больных порфирией cutanea tarda,
осуществлен при помощи ВЭЖХ метиловых эфиров Си-хелатов порфиринов [45].
В соответствующие комплексы порфирины переводили после их этерификации,
обрабатывая 0,1%-ным раствором ацетата меди(П) в смеси хлороформ/метанол.
Высушенный остаток растворяли в хлороформе и аликвотную часть полученного
раствора разделяли на колонке (25x0,2 см), заполненной неподвижной фазой
микропак CN с привитыми ал-килнитрильными группами, при элюировании в
изократическом режиме смесью н-гептан/этилацетат/изопропанол (60:40:0,5).
Обнаружение проводили УФ-детектором (400 нм). Полученная хроматограмма
показана на рис. 10.7. Элюирование разделяемых соединений происходит
очень быстро, но порфирины с несколькими карбоксильными группами
разделяются недостаточно хорошо. В своей последующей работе [56] эта же
группа исследователей показала, что можно повысить чувствительность
обнаружения и несколько улучшить качество разделения.
Хелаты эфиров протопорфиринов. Хелаты метиловых эфиров протопорфиринов
IX с атомами цинка и магния были разделены с помощью ВЭЖХ в процессе
исследования комплексообра-зования протопорфиринов в препаратах
этиопластов [46]. Эте-рифицированные хелаты были очищены при помощи ТСХ и
разделены на колонке (25X0,4 см) с браунли лихросорбом при элюировании
смесью ацетон/гексан (15:85) с объемной скоростью 2 мл/мин.
Смешанные метилэтиловые эфиры порфиринов. Авторы работы [29]
опубликовали методику получения и выделения смешанного метилэтилового
эфира уропорфирина на колонке с jli-порасилом при элюировании смесью
этилацетат/н-гептан (55: :45). В процессе изучения с использованием
метода ВЭЖХ фермента уропорфириноген-декарбоксилазы, выделенной из
гемолизата эритроцитов, на полученной хроматограмме порфири-
506 Глава 10
нов некоторые пики идентифицировать не удалось. При сравнении одного из
этих соединений с синтезированными метилэтило-выми эфирами порфиринов
выяснилось, что оно представляет собой гептаметилмоноэтиловый эфир
уропорфирина.
10.3.1.4. Препаративное разделение. Авторы работ [15, 57]
использовали препаративную ВЭЖХ для выделения и очистки эфиров порфиринов
из кала крыс, отравленных гексахлорбензолом. Разделение осуществляли на
колонке (121X2,5 см), заполненной порасилом А (37-75 мкм), при
экспоненциальном градиентном элюировании от гексана до этилацетата (3 ч)
[15]. Хотя разделение длилось довольно долго, разрешение было хорошим.
10.3.1.5. Разделение изомеров. Основная хроматографическая проблема,
связанная с исследованием биосинтеза порфиринов, - это разделение
изомеров.
Эфиры гардеропорфиринов. Одна из первых работ, посвященная этой
проблеме, была опубликована в 1974 г. [44]. Разделение двух изомеров
тетраметилового эфира гардеропорфи-рина - предшественника протопорфирина
IX, содержащего всего одну винильную группу, было осуществлено на колонке
с корасилом II при элюировании смесью хлороформ/циклогексан.
Спустя несколько лет смесь этих соединений и метилового-эфира
протопорфирина IX была разделена в несколько измененных условиях [58].
Элюент представлял собой смесь циклогек-сана и этилацетата (4:1),
обнаружение проводили при помощи, УФ-детектора в области полосы Соре (402
нм).
Эфиры порфирингексакарбоновых кислот. Изучая механизм
декарбоксилирования уропорфириногена, приводящего к образованию
копропорфириногена, авторы работы [59] использовали ВЭЖХ для разделения
изомерных гексаметиловых эфиров порфирингексакарбоновых кислот. Эти
порфирины образуются в; гемолизате эритроцитов цыпленка при инкубировании
его с соответствующими порфирингептакарбоновыми кислотами. Разделение
проводилось на ВЭЖХ-колонке (150X0,5 см) с партиси-лом (5 мкдо) при
элюировании 1%-ным раствором ацетона в хлороформе с объемной скоростью 1
мл/мин.
Эфиры копропорфиринов. Поскольку использовавшиеся ранее методы анализа
порфиринов, включая ВЭЖХ, не позволяют осуществить разделение изомеров
уропорфирина, эти соединения необходимо декарбоксилировать в запаянных
трубках до-соответствующих копропорфиринов. Изомеры полученных
копропорфиринов хроматографируют в виде этиловых эфиров на колонке
(30X0,4 см) с ц-бондапаком при элюировании смесью-ацетонитрил/вода (7:3)
