Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
пиков соответствует числу карбоксильных групп в составе порфиринов. Изо -
изокопропорфирин, 4Ш - ко-пропорфирнИ III.
ион-парного реагента, представляющего собой ионогенное соединение,
растворимое до некоторой степени в неполярных органических растворителях.
Ион-парные реагенты улучшают экстракцию ионогенных соединений и их
разделение на обращенных фазах. Для образования "ионных пар" с кислотными
группами свободных порфиринов в качестве противоиона несколькими группами
авторов был выбран тетрабутиламмонийфосфат [31- 33, 40, 41].
Моча. Авторы работы [31] первыми описали разделение свободных
порфиринов при помощи ион-парной ВЭЖХ на колонке размером 30X0,4 см,
заполненной обращенной фазой ц-бонда-пак С|8. В качестве ион-парного
реагента они выбрали 1 мМ раствор дигидрофосфата тетрабутиламмония.
Элюирование проводили смесью спирт/вода различного состава при объемной
скорости от 1 до 1,5 мл/мин в зависимости от целей разделения. Аликвотную
часть пробы мочи вводили непосредственно в колонку, элюирование
осуществляли смесью метанол/вода (20: :80), обнаружение-по поглощению при
400 нм. Следует отметить, что попытки других исследователей воспроизвести
результаты работы [31], в которой анализ длился в течение 11 мин, не
увенчались успехом.
•'510 Глава 10
t.MHH
Рнс. 10.11. Анализ состава порфирин-карбоновых кислот в моче больных
острой интермиттирующей порфирией.
а - 50 мкл мочи пациента; 6 - 50 мкл стандартной смеси порфиринов.
Нумерация пиков та же, что на рис. 10.9.
10
t. мин
15
20
Рнс. 10.12. Разделение на ц-бондапа-ке свободных порфиринов экстракта
кала больного эритрогепатической прото порфирией.
В отличие от авторов указанной работы авторы данной главы [32, 33, 40)
пришли к выводу, что разделение свободных порфиринкарбоновых кислот
необходимо проводить при градиентном элюировании. Индивидуальные
порфирины от уро- до мезопорфиринов были разделены с хорошим разрешением
на ц-бондапаке С]8 в условиях мультилинейного градиента от 30 до 100%
метанола в воде при концентрации фосфата тетрабутиламмония в том и в
другом 5мМ (pH 7,5) [32, 33] (рис. 10.9). Длительность анализа с учетом
15-минутного уравновешивания колонки стартовым элюентом составляла 45
мин. Объединенные вместе насосы обеспечивали объемную скорость 1 мл/мин.
Обнаружение проводили с помощью детектора по флуоресценции (возбуждение
при 399 нм, испускание при 615 нм). Стартовые условия и профиль градиента
могли несколько меняться при переходе от одной колонки к другой
вследствие различий в их характеристиках.
При использовании описываемого метода ВЭЖХ пробу мочи после простой
фильтрации вводили непосредственно в колонку, причем предколонка не
применялась. Типичная хроматограмма мочи больного порфирией cutanea tarda
приведена на рис. 10.10. Изокопро- и соответствующий копропорфирин III
были отделены друг от друга и от копропорфирина I в описанных выше ус-
Порфирины 511
Копро
Рис. 10.13. Разделение на лихросорбе порфиринов кала больного porphyria
variegata.
ловиях. Предел обнаружения составил 0,2 мг для уро- и 0,1 мг для
копропорфирина. Этого вполне достаточно для количественного аиализа
порфиринов, входящих в состав мочи.
Для идентификации и количественного определения отдельных порфиринов
авторы работы [64] использовали метод введения в пробы мочи определенных
количеств стандартных смесей порфиринов. На хроматограммах мочи больных
острой трансмиттирующей порфирией наблюдаются два заметных пика- уро- и
копропорфирина (рис. 10.11, а). Сравнение хроматограммы этой пробы мочи с
хроматограммой стандартной смеси (рис. 10.11, б) подтверждает, что
копропорфирин содержит 95% изомера III.
Кал. Авторы этой главы [40] первыми провели разделение свободных
порфиринкарбоновых кислот, содержащихся в кале, при помощи ВЭЖХ в
условиях, подобных описанным. Обычно в кале содержатся поддающиеся
обнаружению количества лишь таких порфиринов, которые имеют всего
несколько карбоксильных групп. Разделение порфиринов осуществляли в
мультилинейном градиенте 50-78% метанола в воде в течение 17 мин: колонка
была такой же, как и при проведении анализа порфиринов мочи (неподвижная
фаза - ц-бондапак). На рис. 10.12 показана хроматограмма экстракта кала
больного эритро-гепатической протопорфирией, полученная описанным выше
методом.
Разделение порфиринов кала проводилось также с использованием системы
из 3-см предколонки с обращенной фазой и колонки размером 25x0,46 см с
лихросорбом RP-18. В этом случае элюирование велось в градиентном режиме
смесью ме-
512 Глава 10
2
б
Рис. 10.14. Разделение порфиринов цельной крови при помощи ион-
париой обра-щеино-фазовой хроматографии с октаметиловым эфиром
уропорфирина в качест-
I ее стандарта [41].
I а - нормальная кровь; б - кровь
1 после отравления свинцом.
I 1 - копропорфирин; 2- Zn-npo-
топорфнрин; 3- протопорфирнн;
J___ 4 - внутренний стандарт.
5
танол/вода (от 65 до 90% метанола в течение 12 мин). Время удерживания
