Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
1 мл/мин. Градиент создавался при помощи двух насосов. Обнаружение
осуществлялось по флуоресценции (длина волны возбуждения 420 нм,
испускания 510 нм). Детектор был снабжен светофильтром с узкой полосой
пропускания. На хроматограммах образцов мочи наблюдается заметный фоновый
сигнал и очень большое число непорфириновых флуоресцирующих соединений,
четко отделенных от порфиринов.
Разделению свободных порфиринов мочи при помощи обращенно-фазовой
хроматографии посвящены два реферата [68, 69]. В одном из них описано
разделение свободных порфиринов на неподвижной фазе ODS-силекс I при
элюировании смесью 0,01%-ная уксусная кислота/метанол (36:61). Для
обнаружения применялся детектор по флуоресценции. Однако детального
описания методики в работе [68] не приведено. Авторы работы [69]
использовали колонку с ц-бондапаком фенилом и элюирование 64%-ным
раствором метанола в воде, содержащим 15,6 мМ пентансульфоиовой кислоты и
10 мМ этилендиамин-
Порфирины
515
тетраацетата натрия. Никакие другие детали, особенно касающиеся качества
разделения, не приводятся.
Кровь. В ходе исследования кислотного гидролиза диметилового эфира
протопорфирина IX авторы работы [50] разработали ВЭЖХ-ме-тод разделения
свободных порфиринов и их метиловых эфиров на обращенных фазах (|я-
бондапак С is), позволяющих также проводить разделение порфиринов,
входящих в состав крови. Порфирины, содержащие меньшее число
карбоксильных групп, разделяли при помощи градиентного элюирования,
начиная от Рис 10 16 Быстрое разделенне смеси метанол/вода/ледяная ук-
смесн изомеров I н III уропор-сусная кислота (6:4:1) до смеси фпрпна (для
рутинного анали-метанол/лечяная уксусная кислота ^ г671-(10:1) при
объемной скорости
2 мл/мин. Конечный состав смеси достигался через 13,7 мин, и в это время
элюировался протопорфирин IX. Для обнаружения был применен детектор по
флуоресценции со светофильтром с узкой полосой пропускания, длина волны
возбуждения составила 404 нм, испускания 595 нм. Гидролиз диметилового
эфира протопорфирина IX заканчивался в течение 2-3 ч, дальнейшее
увеличение времени обработки кислотой приводило к разложению
протопорфирина. Авторы этой статьи показали, что метод ВЭЖХ пригоден для
разделения свободных порфиринов, содержащихся в экстрактах крови.
Салми и Тенхунен [51], используя те же хроматографические условия,
исследовали состав порфиринов эритроцитов. Они показали, что таким
способом можно обнаружить только прото-и копропорфирин, поскольку Zn-
протопорфирин разрушается в процессе очистки пробы, включающей экстракцию
сильными минеральными кислотами. В качестве внутреннего стандарта эти
авторы использовали флуоресцеин. Градиентное элюирование проводилось по
методике, описанной в работе [50], при объемной скорости 1 мл/мин. После
достижения конечного состава элюента, на что затрачивалось 10 мин,
элюирование проводилось еще 4 мин. На примере стандартной смеси,
состоящей из уро-и мезопорфирина, была показана возможность эффективного
разделения смеси порфиринов на отдельные соединения методом ВЭЖХ с
обнаружением по флуоресценции.
Авторы работы [48] предложили метод определения Zn-npo-топорфирина и
протопорфирина IX в экстракте проб цельной крови. Метод основан на
хроматографическом разделении пор-
t, мин
33*
516 Глава 10
Рис. 10.17. Разделение порфиринди- (2), порфиринтетра- (4) и
порфирннпентакарбо-новых (5) кислот (профиль градиента показан штриховой
линией) [15].
t.MMH
фиринов на колонке с ц-бондапаком Qg в условиях изокрэтического
элюирования смесью метанол/уксусная кислота/вода (39 : :4:7, pH 3,4) при
объемной скорости 2 мл/мин. Время удерживания протопорфирина составило
всего лишь 5 мин. Описанную методику ВЭЖХ авторы работы сравнили с
несколькими другими методами анализа порфиринов крови и показали, что она
превосходит другие методы по селективности и чувствительности.
В работе [49] описано разделение порфиринов эритроцитов на колонке с
ц-бондапаком С(8, объединенной с предколонкой, заполненной поверхностно-
пористой неподвижной фазой ODS. Элюентом служил 8%-ный водный буферный
раствор КН2РО4 (pH 3,4) в метаноле (8 : 92), элюирование осуществлялось в
изократическом режиме с объемной скоростью 2 мл/мин. Обнаруживали
протопорфирины флуориметрически при обычных длинах волн. Таким способом
было осуществлено разделение мезо-, прото-, копро- и Zn-протопорфиринов.
Хорошее разделение смеси свободных порфиринкарбоновых кислот достигалось
всего за 6 мин. Выход протопорфирина и его Zn-хелатного комплекса
превышал 90%. Экстракция порфиринов, содержащихся в пробах крови,
проводилась тремя различными методами. Наилучшие выходы дала ВЭЖХ проб,
полученных экстракцией смесью этилацетат/уксусная кислота (3:1).
10.3.2.3. Разделение при помощи ионообменной хроматографии. В 1975
г. Эванс и др. [15] описали пример разделения методом ионообменной
хроматографии смеси порфириновых ди-, тетра- и пентакарбоновых кислот
