Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
порфиринкарбоновые кислоты. В работах [20, 39] описано несколько способов
экстракции с последующим спектроскопическим исследованием полученных
фракций порфи-ринов. Однако рекомендуемые в этих работах смеси
растворителей не позволяют провести полную экстракцию уропорфири-нов.
Наилучшие результаты, как показали эксперименты, проведенные на
стандартных смесях порфирниов, добавленных к пробам кала, дает экстракция
смесями метанол/вода, к которым добавлен фосфат тетрабутил аммония [40].
50 мг сухого диспергированного кала экстрагируют по меньшей мере тремя
порциями (1 мл каждая) 60 мМ раствора фосфата тетрабутиламмония в смеси
метанол/вода (80:20); последний экстракт не должен давать красной
флуоресценции. Объединенные экстракты центрифугируют и аликвотную часть
надосадочной жидкости вводят непосредственно в хроматографическую колонку
(рис. 10.4).
10.2.3. Кровь, ткани и другие объекты
Определение порфнринов в цельной крови и в эритроцитах широко применяют
для выявления отравлений свинцом [41] и исследований биосинтеза порфирина
[42]. Определение порфирина в плазме или сыворотке крови необходимо лишь
в считанных случаях [43]. Под действием растворителей, используемых для
Порфирины 499
экстракции и этерификации, эритроциты обычно подвергаются лизису.
Животные ткани, а также бактерии перед выделением порфиринов следует
гомогенизовать, поскольку их клетки более устойчивы.
Из животных тканей порфирины в большинстве случаев выделяют в виде
эфиров, поскольку это облегчает экстракцию.
10.2.3.1. Эфиры порфиринов. Экстракция растворителями. Перед
этерификацией проб клеток и тканей обычно проводят их экстракцию [42,
44]. Гомогенат клеток дважды экстрагируют смесью этилацетат/уксусная
кислота (7:3). Объединенную над-осадочную жидкость промывают 3%-ным
водным раствором ацетата натрия и далее водой. Из органической фазы
порфирины вначале экстрагируют водным раствором соляной кислоты и после
этого реэкстрагируют эфиром. Эфирную фракцию промывают водой, эфир
выпаривают, сухой остаток обрабатывают этерифицирующими реагентами [42,
44].
Адсорбция на тальке. Белки из гемолизата эритроцитов осаждают
раствором хлорной кислоты в этаноле и удаляют. Доводят pH надосадочной
жидкости до 3,5 и добавляют в раствор тальк, на котором адсорбируются
порфирины [30]. Дальнейшая процедура осуществляется так же, как и при
обработке проб кала (см. схему на рис. 10.3).
Этерификация. Порфирины. Другой метод, описанный авторами работ [25,
48], заключается в прямой этерификации гомо-генизата указанными выше
реагентами. Последующая процедура очистки аналогична используемой при
обработке проб кала (см. схему на рис. 10.3).
Хелаты порфиринов. В работе [46] опубликован метод этерификации цинк-
и магний-хелатов протопорфирина, предназначенный для исследований
процесса комплексообразования порфиринов, протекающего в клетках [46].
Хелаты порфиринов были очищены с помощью ТСХ и далее переведены в
метиловые эфиры диазометаном.
10.2.3.2. Свободные порфирины. Порфирины эритроцитов содержат в
основном цинк-протопорфирины [47], исследовать которые можно лишь очень
немногими методами [41, 48, 49], поскольку металлопорфирины разлагаются
сильными кислотами.
Разделение гемолизата. Авторы работы [41] использовали для определения
содержания порфиринов пробы цельной крови, обработанной смесью тритона Х-
100 и 50 мМ раствора тетра-бутиламмонийгидроксида в воде (pH 7,5). После
центрифугирования аликвотную часть надосадочной жидкости вводили
непосредственно в хроматографическую колонку.
Экстракция растворителями. Кровь. Экстракция смесью этнл-
ацетат/уксусная кислота (3:1) была использована для предва-
32*
500 Глава 10
рительной обработки пробы двумя группами исследователей [48, 49]. В
хроматографическую колонку они вводили аликвотную часть полученной
органической фазы. Хотя вводимые в колонку пробы содержали некоторое
количество гемина и родственных ему соединений, мешающих обнаружению
порфиринов, их влияние можно свести до минимума, если подобрать такие
условия разделения, которые обеспечат его селективность.
Чтобы удалить соединения, мешающие обнаружению порфиринов, их повторно
экстрагируют из органической фазы соляной кислотой [50, 51]. Выделить
динк-протопорфирин не удается ни из солянокислого раствора [50], ни из
раствора порфирина в элюенте после дополнительной их экстракции эфиром
[51].
Плазма. Аналогичный метод экстракции был использован для выделения
свободных порфиринкарбоновых кислот [43].
Ткани. Авторы работы [31] провели анализ состава свободных порфиринов,
содержащихся в тканях глубоководной медузы. Гомогенизованную пробу
экстрагировали элюентом, состоящим из смеси водного 1 мМ
тетрабутиламмонийдигидрофосфата и этанола (17: 3). Полученный экстракт
фильтровали и аликвотную часть фильтрата без какой-либо дополнительной
очистки вводили непосредственно в колонку.
10.3. Методики разделения
Разделение порфиринов имеет чрезвычайно важное практическое значение в
