Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
применения градиентного элюирования время удерживания значительно
уменьшилось, например метиловый эфир уропорфирина выходил из колонки
через 12 мии. Обнаружение копропорфирина проводилось при 400 нм, предел
обнаружения составлял 1-2 пмоль. Для метода характерна высокая
воспроизводимость времени удерживания, что облегчает идентификацию пиков
по стандартам. Для количественного анализа использовался внутренний
стандарт - в данном случае мезопорфирин IX, который следует добавлять в
образец перед этерификацией и экстракцией. Для проведения разделения
необходимо 10-20 пмоль компонентов, причем количества материала,
собранного при элюировании одного пика, достаточно для последующего его
масс-спектрометрического анализа, который позволяет идентифицировать
структуру метиловых эфиров порфиринов (после их разделения).
При разделении на колонке (25X0,2 см), заполненной лихросорбом SI 100,
в условиях градиентного элюирования время удерживания порфиринов
относительно мало (<6 мин) [55]. Градиент формируется в результате
увеличения концентрации тетрагидрофурана в гептане от 20 до 50% в течение
7 мин (2 мл/мин). Обнаружение осуществлялось при 400 нм (полоса Соре).
Образец эфиров порфиринов необходимо растворять в хлороформе, поскольку в
элюенте они плохо растворимы. Чтобы разрешение было приемлемым, объем
вводимой пробы не должен превышать 50 мкл.
Порфирины 503
10.3.1.3. Изократическое элюирование. Метиловые эфиры порфиринов.
Хроматограммы метиловых эфиров порфиринов мочи представлены в работе
Эванса и др. [18], которая была опубликована позднее, чем описанный выше
метод. Разделение эфиров порфиринов, содержащих от 2 до 8 карбоксильных
групп, было осуществлено на колонке (20X0,4 см), заполненной пар-тисилом
(5 мкм), менее чем за 10 мин. Элюирование проводили смесью
этилацетат/циклогексан (60:40) в изократическом режиме с объемной
скоростью 1,5 мл/мин. Следует отметить, что разделение эфиров
порфиринкарбоновых кислот - от ди- до пентаэфиров, содержащихся в моче,
было недостаточно хорошим для количественной идентификации всех
порфиринов. Очистка проб проводилась тремя различными методами;
результаты хроматографического анализа во всех трех случаях совпадали.
В 1977 г. Грей и др. [19] опубликовали метод разделения при помощи
ВЭЖХ порфиринов, входящих в состав мочи или кала больных, страдающих
практически всеми видами порфи-рии. Разделение проводили на колонке
(30X0,4 см) с порасилом при изократическом элюировании смесью н-
гептан/метилацетат (3:2) при объемной скорости 1,5 мл/мин. Для
обнаружения использовали УФ-детектор (404 нм). Метиловые эфиры порфиринов
элюировались с хорошим разрешением в порядке увеличения полярности их
молекул. Время удерживания эфиров мезо-и уропорфиринов составляло от 4 до
16 мин соответственно.
Приведем в качестве примера две хроматограммы, показывающие, какие
порфирины содержатся в кале и моче больных врожденной копропорфирией
(рис. 10.5) и в моче больных кон-гинетальной эритропоэтической порфирией
(рис. 10.6).
В двух более ранних публикациях те же авторы изложили результаты
исследования влияния на разделение эфиров порфиринов хроматографических
условий, включая программирование объемной скорости и состава элюента
[26, 54]. Однако наилучшее разделение смесей метиловых эфиров порфиринов,
причем за приемлемое время, было достигнуто при изократическом
элюировании.
Авторы работы [20] провели сравнительное изучение фракционирования
порфиринов методом экстракции смесью соляной кислоты и эфира и методом
ВЭЖХ. Хроматографическое разделение проводили по методу, описанному в
работе [19]. В пробу кала до этерификации вводили в качестве внутреннего
стандарта дейтеропорфирин. Чтобы исключить влияние эндогенного
дейтеропорфирина, пробу кала анализировали как в присутствии, так и в
отсутствие внутреннего стандарта.
Как выяснилось, метод фракционирования дает ошибочные (завышенные)
результаты из-за наличия протопорфирина в коп-ропорфириновой фракции.
504 Глава 10
t.MMH
Рис. 10.5. Хроматограмма метиловых эфиров порфиринов, содержащихся в моче
больных врожденной копропорфирией [19].
Напротив, при использовании метода ВЭЖХ разделение было полным, так
что возможная причина ошибки была исключена.
Си-хелаты порфириновых эфиров. Анализируя состав стандартной смеси
метиловых эфиров порфиринов, выдержанных в течение трех суток в
разбавленном растворе хлороформа, Эванс и др. [18] обнаружили в ней
неизвестные соединения. Разделение этой смеси проводилось в тех же
условиях, что и разделение эфиров порфиринов (неподвижная фаза -
партисил, элюент смесь этилацетат/циклогексан). Масс-спектрометрический
анализ показал, что неизвестные соединения представляют собой Cu-хелаты
порфириновых эфиров. Вероятно, следы кислоты, содержащиеся в хлороформе,
вызывали растворение микроколичеств меди из стенок сосуда, в котором
находилась смесь
М' Рис. 10.6. Хроматограмма ме-
| тиловых эфиров порфиринов,
