Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
такой способ дает лишь общую элементную концентрацию образца, он реально
показывает, были ли основные изменения результатом данной процедуры
препарирования.
3) Необходимо знать химический состав утраченного или приобретенного
образцом материала. Важно знать не только, произошли ли изменения
концентрации элементов в образце, но и являются ли эти изменения
селективными. Элементы в биологических образцах обычно размещаются в
различных фрагментах, каждый из которых имеет различный состав. Внутри
любой перегородки одного фрагмента элементы могут быть слабо или сильно
связаны, и процедура препарирования может селективно воздействовать на
концентрацию определенного элемента.
4) Необходимо знать количество перераспределенных и перемещенных внутри
образца элементов. Несмотря на то что данная методика препарирования
может не изменять общую концентрацию элементов в системе, она может
вызвать сильное перераспределение элементов внутри ткани. Искусственное
движение материала в образце является самым сложным явлением, которым
надо управлять. Наблюдение необычайно высоких
Препарирование биологических образцов для РМА
27&
концентраций элементов как в кристаллах, так и в осадках подтверждает
наличие перераспределения.
5) Элементы, используемые для препарирования образцов, не должны
маскировать элементы, подлежащие анализу. Если исследуются спектры
характеристического рентгеновского излучения элементов, то возможно
увидеть перекрывание линий их К-, L- и М-излучения, в особенности в
спектрах, полученных с помощью рентгеновского спектрометра с дисперсией
по энергии с его плохим разрешением по энергии. Пока не приняты
соответствующие меры L- или М-излучение одного элемента может
перекрываться и маскировать /(-излучение анализируемого элемента. В табл.
6.1 гл. 6 указывается тип перекрытий, который может случиться для
некоторых элементов, используемых при препарировании объекта, и некоторых
из наиболее легких элементов, представляющих интерес для биологии.
Во многих случаях нет необходимости подвергать образцы сложному
предварительному тестированию или процедурам препарирования, так как
параллельные физиологические и биохимические исследования покажут,
вызывают ли процедуры препарирования изменения. В связи с тем что не
существует другой надежной аналитической процедуры для подтверждения
точности микроанализа на этом уровне, независимую оценку точности анализа
получить трудно.
12.2. МЕТОДЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ ПРИ ОБЫЧНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ
12.2.1. Перед фиксацией
В общем задержка по времени при получении кусочка ткани или клеток из
экспериментального организма должна быть минимальной. Имеется достаточно
сведений о морфологических эффектах аноксии, стресса и посмертных
изменений, чтобы предположить, что, по-видимому, также изменяются
локальные концентрации элементов. Необходимо предпринимать также меры
предосторожности при удалении всех загрязняющих организм жидкостей,
таких, как кровь, слизь, межклеточные жидкости, которые могут собираться
в организме и привести к возникновению ложных сигналов рентгеновского
излучения. Подробности необходимых процедур приведены в гл. 11 по
препарированию образцов для растровой электронной микроскопии.
12.2.2. Фиксация
Вопросом первостепенной важности является выбор фиксатора, который не
вызывает потерь, перераспределения или маскирования анализируемых
элементов. Это является одним из пер-
276
Глава 12
А В С D Е F G Заливка эпоном Высушенный заморамива -
нием И лиофильной сушкой
Рис. 12.3. Электронные микрофотографии и гистограммы отношений пик/фон, в
которых сравнивается количество серы, сохранившейся в клетках рогового
слоя человека, подвергавшихся различным экспериментальным процедурам
препарирования [406].
на а-д маркер соответствует 5 мкм; на е, ж маркер соответствует 2 мкм.
Обозначения A - G на гистограммах соответствуют обозначениям а-ж на
микрофотографиях. а - фиксация в осмии, заливка эпоном; б - фиксация в
глутаральдегиде, заливка эпоиом; в - фиксация в глутаральдегиде и осмии,
заливка эпоном; г - фиксация в осмии, лиофильная сушка; б -фиксация в
глутаральдегиде, лиофильная сушка; е - фиксация в глутаральдегиде и
осмии, лиофильная сушка; ж - без фиксации, лиофильная сушка. Отметим, что
лучшей сохранности элементов соответствует худшая сохранность морфологии.
вых пунктов, которые должны проверяться с помощью, напри-мер,
спектрометрии в пламени на фиксирующих жидкостях до и после фиксации.
Было проведено очень мало систематических исследований для изучения
влияния препарирования образца на концентрацию элементов тканей. В работе
[404] исследовались воздействия ряда разнообразных фиксаторов на
концентрацию ионов мышцы лягушки и ткани крысы [405]. Подобные
исследования на коже человека были проведены в работе [406], основные
результаты которой показаны на рис. 12.3. Эти исследования являются
убедительной демонстрацией того, что все методы фиксации оказывают
некоторое воздействие на исход-
