Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
возникают в любом препарированном для электронного микроскопа образце, от
структуры биологического происхождения, которую мы пытаемся выявить.
Глава 12
ПРЕПАРИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ РЕНТГЕНОВСКОГО МИКРОАНАЛИЗА
12.1 ВВЕДЕНИЕ
Любой метод препарирования для рентгеновского микроанализа должен
приводить к четко распознаваемой структурной неоднородности, в то же
время сохраняя in situ элементные составляющие, которые собираются
проанализировать. Часто это бывает затруднительным, и для достижения этой
цели были разработаны тончайшие методы препарирования. Во многих
отношениях принципы методов препарирования для рентгеновского
микроанализа не отличаются от методов, используемых в растровой
электронной микроскопии. Важное различие состоит в том, что методы
препарирования, хотя и призваны сохранять ультраструктуру, не должны
достигать этой цели за счет растворимых составляющих клетки. В
последующем изложении мы не намереваемся давать бесчисленные рецепты,
котроые могли бы быть применены к специфическим биологическим системам,
а, наоборот, рассмотрим принципы, подчеркивающие методологию и, таким
образом, позволяющие экспериментаторам разрабатывать свои собственные
методы для конкретного исследуемого образца. Предмет не является новым,
и, хотя будет сделана попытка привести детали некоторых наиболее новых
достижений, ссылки следует сделать на более ранние исследования и
коллективные статьи [387, 320, 208, 388, 184, 206], в которых даются
рецепты для специфических биологических образцов.
12.1.1. Природа и широта проблемы
Микроанализ в биологических образцах может быть определен как нахождение
и измерение малых количеств элементов, молекул и даже макромолекул с
высоким пространственным разрешением в биологических матрицах, обладающих
обычно малой плотностью. Термин "микроанализ" обычно связан с
рентгеновским микроанализом--методом, в котором локализуется и измеряется
элементный состав образцов. С помощью имеющихся в настоящее время
детекторов минимальное количество элемента в биологической ткани, которое
может быть измерено с помощью рентгеновского микроанализа, составляет
приблизительно 10-19 г при пространственном разрешении 20-
266
Глава 12
30 нм и пределе разрешения в массовых долях порядка 1 мМ/кг [179].
Биологи предпочитают термин "локальная массовая фракция" для определения
концентрации элемента. Массовая фракция определяется как отношение массы
элемента в анализируемом микрообъеме к общей массе образца в том же самом
микрообъеме. Объяснение того, что измеряется в микроанализаторе, включая
более точное определение термина "локальная массовая фракция" и измерение
по отношениям элементов, дается в статьях [389 и 179].
Идеальным образцом для рентгеновского микроанализа был бы тонкий, гладкий
срез стабильного материала с низким атомным номером, с хорошими тепловыми
и электрическими свойствами, содержащий включения с высокой локальной
концентрацией элементов. Тонкая алюминиевая фольга толщиной ~200 нм,
содержащая включения золота, вероятно, была бы наилучшим приближением к
такому образцу. К сожалению, биологический материал находится весьма
далеко от этого идеала.
Биологические объекты являются трехмерными нестабильными влажными
изоляторами. В основном они состоят из органических молекул и
макромолекул, окруженных ионами и электролитами с малой концентрацией.
Степень связи компонент элементов простирается от относительно сильных
ковалентных связей, обнаруженных в содержащих серу белках, до свободно
диффундирующих в цитозоле ионов калия.
Характерным свойством живого материала является то, что он движется.
Степень движения меняется от явного перемещения в потоке цитоплазмы до
движения ионов, электролитов, молекул и макромолекул относительно друг
друга внутри клетки. В результате обмена веществ биологический материал
постоянно изменяется, разрушая и перестраивая функциональную архитектуру
клетки. Эта выраженная нестабильность мешает проведению рентгеновского
микроанализа, если не найдены пути мгновенного сдерживания активности
клетки и удержания ее в этом состоянии до тех пор, пока выполняются
исследования. Если бы это было сделано, то окружающая среда, в которой
должен производиться рентгеновский микроанализ, полностью была бы лишена
жизненных процессов. Типичный одноклеточный организм менее 2 мкм в
поперечнике синтезирует много сотен соединений путем тонкого
регулируемого процесса, способен воспроизводить сам себя и генетически
эволюционировать и видоизменять эти процессы. Если захотелось бы найти
быстрый способ разрушения этого уникального тончайшего механизма, то,
вероятно, не нашлось бы ничего лучше потока быстрых электронов, который
за одну секунду смог бы испарить количество воды, во много раз
превышающее вес образца.
Препарирование биологических образцов для РМА
267
Как указывалось ранее, биолог должен выбрать компромисс между свойствами
образца и условиями, в которых должен проводиться анализ. Оказывается,
