Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
высушенным до проведения исследования. Видно много пиков. Доминирует пик
калия. Наличие пика кальция могло быть из-за высокой концентрации этого
элемента в компонентах саркоплазматического ретнкулума. присутствующих в
анализируемой колонке.
280
Глава 12
содержит мышьяк). Однако интересные и безусловно полезные вариации по
этому вопросу были недавно опубликованы в [408], где смогли
идентифицировать состояние с высоким сродством кальция в Paramecium
фиксацией клеток при наличии высоких концентраций кальция. Важно также
проверить, что pH жидкостей, используемых при препарировании, не приводит
к изменениям растворимости элементов. Исследователям, интересующимся
"влажными химическими" методами препарирования для микроанализа, мы
рекомендуем прочитать недавно опубликованную обзорную статью [409].
В качестве альтернативы химической фиксации существует горячая фиксация.
Клетки или тонкие срезы ткани помещаются на подходящую подложку,
освобождаются от избыточной жидкости, а затем помещаются в пламя газовой
горелки. Такая драконовская мера хотя и является разрушающей и вызывает
морфологическое изменение и химическое перераспределение, тем не менее
использовалась для успешного препарирования образцов для рентгеновского
микроанализа.
12.2.3. Гистохимические методы
Специалистам, работающим в области оптической и электронной микроскопии,
было давно известно, что можно локализовать области со специфической
физиологической и/или метаболической активностью, используя строго
определенные красители и гистохимические агенты. Та же самая идея может в
Рис. 12.5. Пример применения модифицированного метода Гомори.
о - полученная в ПЭМ микрофотография среза клеток планарного ацидофила
подвергнутого тесту Гомори на свинец для кислой фосфатазы. Виден осадок
свинца XI5 ООО Маркер соответствует | мкм; б - рентгеновские спектры
видимых иа рис. а окрашенных ядер, полученных с помощью спектрометра с
дисперсией по энергии и демонстрирующие наличие пика Хадля фосфора. Видны
пики Ма La и Lj3 для свинца и Х-пики меди [410].
Препарирование биологических образцов для РМА
281
принципе быть использована в рентгеновском микроанализе. На рис. 12.5,
взятом из работы ([410], показаны плотные для электронов осадки,
полученные с помощью модифицированного метода Гомори для кислой
фосфатазы; рентгеновские спектры подтверждают наличие свинца. В отличие
от электронной микроскопии вовсе не обязательно, чтобы конечный продукт
был тяжелым металлом, если он существенно отличается от объема матрицы
образца. Например, голубой алциан для муцина содержит медь, серу и хлор,
которые легко определяются с помощью рентгеновского микроанализа. В
работе [410] была локализована активность фосфатазы с помощью
азокрасителя, который имеет три ковалентно связанных "меченых" атома
хлора. В работах [411-413] дается обзор применения гистохимических
методов в микроанализе. В недавно опубликованной работе [414] приводится
обширный обзор гистохимических аналитических методов, которые могут быть
применены для растительного материала. Подобный обзор, имеющий дело в
основном с тканью животных, был опубликован в работе [415].
12.2.4. Методы осаждения
Многие исследователи пытались осаждать диффундирующие элементы in situ до
того, как произойдет фиксация. Этот метод основан на реакции иона с
соединением тяжелого металла для создания плотного для электронов осадка,
который можно либо наблюдать в просвечивающем электронном микроскопе,
либо обнаруживать в рентгеновском микроанализаторе. В табл. 12.1
Таблица 12.1. Реакция осаждения для in situ демонстрации неорганических
И'ОНОВ и АТФ -азы в растительных и животных тканях
Животные образцы Растительные образцы
Ион или АТФ-азы Осаждающий реактив Ион или АТФ-азы Осаждающий
реактив
CI- Ag-ацетат или CI- Ag-ацетат или
Ag-лактат Ag-лактат
Na+ К-пироантимонат Na+ К-пироантимонат
Na+, Mg2+, Са2+ К-пироантимонат Na+, Mg2+, Са2+ К-пироантимоиат
Na+, К+, Mg2+, К-пироантимонат Na+, Са2+ Бензамид
Cas+, Mn2+ Са2+ NHi-оксалат
Ca2+ К-пироантимонат ро4- РЬ-ацетат
К-пироантимонат АТФ-азы Pb(N03)2
или оксалат
К-оксалат
POi,- РЬ-ацетат
АТФ-азы Pb(N03)2
или Са2+
282
Глава 12
Рис. 12.6. Локализация натрия и кальция в нервной ткани методом осаждения
с использованием пироантимоната осмия [417].
а - изображение неокрашенного перехвата Ранье, полученное в ПЭМ, на
котором видно распределение пироантимонатных осадков. Большие зерна
встречаются в аксоплазме (белая стрелка), а зерна меньших размеров
ограничены цитоплазмой паранодальных петель (черные стрелки). Маркер
соответствует 0,5 мкм; б - изображение паранодальной области перехвата
Ранье, полученное в ПЭМ, на котором видны лмроантимонатные осадки Осадки
в виде маленьких зерен видны в цитоплазме паранодальных петель (белые
орелки), а большие зерна осадков находятся внутри акеоллазмы (черные
стрелки). Маркер соответствует О.о мкм. Рентгеновский микроанализ,
проведенный г помощью крисгалл-ди-фракцнонных спектрометров показал, что
