Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
соотношении 1 : 2, или летучих органических твердых веществ, таких, как
камфора, лишь немногим лучше, и это должно использоваться лишь в крайних
случаях.
Химическое обезвоживание может быть достигнуто пропусканием фиксированных
тканей через несколько смен метилового или этилового спирта или ацетона.
Это может быть сделано либо полной заменой одной концентрации на другую,
либо медленным, но непрерывным закапыванием большого объема
Препарирование биологических объектов для РЭМ
247
Рис. 11.21. Культура клеток фибропласта мыши [366].
а - обезвоженные (дегидратированные) этанолом; б - обезвоженные
(дегидратированные* 2,2-диметоксипропаиом.
100%-ного спирта или ацетона в маленький контейнер, содержащий образец.
Преимущество последнего метода в том, что образец не подвергается
внезапным изменениям концентрации. Должны быть приняты меры
предосторожности, чтобы не были использованы денатурированные спирты и
ацетон, так как это может привести к возникновению на поверхности образца
маленьких иглообразных загрязнений. Температура обезвоживания неважна,
хотя обычно обезвоживание производится при той же температуре, что и
фиксация. Важно помнить, что 100%-ный
248
Глава It
Рис. 11.22.
а - клетки опухоли мастоцитома (на которых видны ворсинки), изготовленные
сушкой в критической точке; б - те же клетки, изготовленные
непосредственной сушкой с использованием фреона-113. Поверхность клетки
опухоли мастоцитома, исследованной в РЭМ с полевой эмиссией (в, г): в -
изготовленная сушкой в критической точке. Отметим здесь пористость
мембран поверхности клетки; г - изготовленная методом непосредственной
сушки. Отметим, что отверстия иа мембранах поверхности клетки видны
[367].
спирт или ацетон является очень гигроскопичным, и может ока-заться
необходимым производить последнюю стадию обезвоживания либо в сухой
атмосфере, либо в присутствии подходящего влагопоглощающего вещества.
Быстрое химическое обезвоживание может достигаться при использовании 2,2-
диметокси-
Препарирование биологических объектов для РЭМ
249
Рис. 11.22 (продолж.).
пропана. Образцы ткани помещаются в подкисленные растворы 2,2-
диметоксипропана, который быстро превращает воду ткани в ацетон и
метиловый спирт. Так как протекает эндотермическая реакция, ткани затем
проходят через три смены этанола, метанола или ацетона. Если необходимо
произвести быстрое
250
Глава 11
препарирование, тогда этот способ обезвоживания является эффективным.
Более предпочтительными являются медленные способы, так как при более
быстром методе, возможно, существует опасность деформирования ткани, в
частности больших размеров образцов. В работе [366] проделано тщательное
сравнение сохранности культур тканей при использовании методов
обезвоживания с помощью метанола и диметоксипропана (DMP), и оказалось,
что большой разницы между двумя способами нет (рис. 11.21).
Деформирование ткани в процессе обезвоживания может быть уменьшено, если
на ранних стадиях осушитель (этанол, ацетон и т. д.) разбавляется
буфером, использованным для фиксации.
В работе [367] показано, что отдельные клетки культуры ткани можно
высушить в эксикаторе с помощью фреона-113 при комнатной температуре.
Клетки, укрепленные на покровных стеклах, фиксируются и проходят
обезвоживание в 100%-ном этаноле, а затем проходят через постепенные
изменения концентрации фреона-113 вплоть до 100%. Образцы, погруженные в
фреон-113, переносятся в эксикатор, содержащий Drierite, и откачиваются
до давления 3 Па (3-10~2 Торр). Жидкая фаза фреона-113 испаряется в
течение нескольких минут, оставляя клетки, ультраструктура которых
сравнима со структурой клеток, высушенных методом сушки в критической
точке (рис. 11.22). Дальнейшие исследования должны показать, может ли эта
методика быть эффективно использована для кусочков тканей. В работе [368]
разработан метод, который позволяет высушивать образцы от этанола в струе
сухого аргона без использования сушки в критической точке. Методика дает
столь же хорошие результаты, как и другие методы, хотя на чувствительных
образцах, таких, как мерцательный эпителий, метод сушки в критической
точке дает лучшие результаты.
Трудно указать промежуток времени для проведения эффективного
обезвоживания, потому что, как и фиксация, обезвоживание очень сильно
зависит от размера образца, пористости и от того, должны ли исследоваться
внутренние и/или внешние характеристики клетки.
Ориентировочно большинство блоков ткани размером 1 - 2 мм3 эффективно
обезвоживается через 15 мин в 15-, 30-, 50-, 70-, 95 и 100%-ном этаноле
или ацетоне с последующими тремя 10-минутными сменами в безводном
растворителе, а вся процедура выполняется примерно в течение 2 ч. В
работе [369] показано, что структура лучше сохраняется, если
обезвоживание производится непрерывно, а не последовательно в несколько
ступеней.
Время процесса препарирования является достаточно важным, чтобы можно
было избежать незапланированных задер-
