Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Препарирование биологических образцов для РМА
277
ные распределения элементов в тканях. В то время как криобиологические
методики незначительно влияют на концентрацию электролита ткани, влажные
химические методы оказывают весьма пагубное влияние. Все фиксаторы
оказывают неблагоприятное воздействие на диффундирующие несвязанные
элементы и могут влиять различным образом на связанные элементы. В
недавно опубликованной обзорной статье [184] содержится краткий перечень
потерь элементов, обнаруженных при различных способах фиксации,
выполненных на широком наборе типов ткани. Вырисовывается довольно
мрачная картина, достаточная, чтобы разочароваться в использовании
фиксаторов, особенно когда подлежат анализу диффундирующие элементы. Было
показано, что обычно используемые фиксаторы, такие, как органические
альдегиды, вызывают значительную потерю растворимого материала из клеток.
На рис. 12.4, взятом из работы [407], продемонстрировано, как фиксаторы и
красители могут изменять аналитическую информацию от образцов. Быстрая
фиксация приводит к огромным ионным изменениям, а получение срезов с
вытеканием жидкости приводит к экстракции элементов. Если в качестве
фиксаторов используются альдегиды, то важно проверить, не накопились ли
они в углекислом барии. Вероятно, лучше использовать свежий
дистиллированный материал. Потеря растворимых элементов усиливается в
процессе последующей фиксации в осмии и перманганате, которые вносят
дополнительные сложности, маскируя анализируемые элементы. Если
совершенно ясно, что для некоторого рода ткани необходима стабилизация и
если должны быть использованы фиксаторы, то время фиксации должно быть
как можно короче, и предпочтительнее использовать фиксаторы в газовой
фазе, а не в более обычном жидком состоянии, чтобы уменьшить
перераспределение растворимых элементов. Использовались пары четырехокиси
-осмия и формальдегида, но глубина проникновения фиксатора ограничена, и
лишь маленькие образцы можно успешно обрабатывать таким образом. В работе
[396] обработка в парах осмия применялась к блокам ткани, высушенным в
замороженном состоянии, а в работе [199] обрабатывались срезы, высушенные
в замороженном состоянии. Основное преимущество обработки осмием
заключается в том, что он улучшает контраст ткани, но ткань должна
использоваться лишь в том случае, если наличие осмия не влияет на анализ.
Органические буферы, такие, как бикарбонат, пиперазин-Ы,Ы/-бис-2-
этанолсульфокислота, ацетат веронала и коллидин, являются более
предпочтительными по сравнению с большинством обычно используемых
неорганических буферов, так как всегда имеется опасность, что последние
могут вносить нежелательные элементы в клетки (например, какодилатный
буфер
tMrtM
Препарирование биологических образцов для РМА
279
^ ;
Ыа SiPSCi
Рис. 12.4. Изменения элементного состава тканей за счет различий в
методах препарирования [407].
Продольные срезы волокон скелетной мышцы. Митохондрия (т), толстые и
тонкие мио-филамснты, заключенные в А{А). /(/) и Z-полосах (Z), части
саркоплазматического ре-тикулума (стрелки н tc означают терминальные
цистерны). Все криосрезы были неокра-шены. Спектры получены при анализе
срезов. Анализ проводился в середине Д-полосы. Диаметр пятна пучка
составлял 0,5 мкм. Под спектрами стрелки указывают ожидаемые положения
линий, возникающих при излучении определенного элемента. а - стандартное
влажное химическое препарирование. Реактивы, использованные для фиксации
и окрашивания, препятствовали идентификации в действительности имеющихся
ионов из-за перекрытия энергетических пиков. Здесь появился необъяснимый
пик алюминия; б - срезы, нарезанные с использованием раствора 50%-ного
DMSO в дистиллированной воде в качестве переходной жидкости; волокно
стабилизировано в глутаральде-гиде (5 мии) и заморожено. После резки срез
промывался в дистиллированной воде и высушивался иа воздухе. Обнаружено
лишь несколько элементов; в - нефиксированное, замороженное и разрезанное
во влажном состоянии (50%-ного диметилсульфоксида в дистиллированной
воде) мышечное волокно. Срез затем промывался в дистиллированной воде и
высушивался на воздухе. Присутствует пик калия, а также относительно
интенсивный пик хлора. Часто появлялся пик серы, хотя здесь его иет; г -
обработанное глицерином мышечное волокно (30%-ного глицерина в
дистиллированной воде), замороженное без фиксации и разрезанное в
высушенном виде. Срез подвергался лиофильной сушке. Признаков повреждений
из-за образования кристаллов льда в процессе замораживания не
наблюдалось. Обнаружено лишь несколько элементов; д - разрезанный в
высушенном состоянии и высушенный лиофильной сушкой срез
стабилизированного глу-таральдегидом и замороженного волокна. Интенсивные
пики натрия и хлора. Эти элементы, вероятно, возникли из используемых
растворов; е - нефиксированное, замороженное и разрезанное в высушенном
состоянии мышечное волокно. Срез подвергался лиофильной сушке и хранился
