Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
криопротектантами, такими, как глицерин или диметилсульфоксил, приводит к
не-
Препарирование биологических объектов для РЭМ
253
которому уменьшению усадки объема, но в свою очередь создает другие
проблемы. Криопротектанты остаются в образце после сушки и будут медленно
газить во вне и затенять образец, а также загрязнять колонну микроскопа.
Гажение можно уменьшить, исследуя образцы при низкой температуре или
используя непроникающие высокомолекулярные полимерные криопротектанты,
такие, как поливинилпирролидон или оксиэтиловый крахмал (см. гл. 12).
Практические рекомендации относительно того, как лучше выполнить эту
процедуру, даны в гл. 12 по препарированию образцов для микроанализа и в
недавно вышедшем обзоре [375], но вкратце процедура происходит следующим
образом: маленькие кусочки образца быстро замораживаются в подходящей
охлаждающей смеси, такой, как плавящийся фреон-13, и переносятся в жидком
азоте на предварительно охлажденный столик аппарата для лиофильной сушки.
Камера аппарата для лиофильной сушки откачивается до рабочего вакуума
порядка 20-100 МПа, при котором происходит сублимация льда из образца.
Сублимация льда является функцией температуры и давления: чем меньше
температура, тем выше требуется вакуум для того, чтобы вода могла
испариться из образца. В большинстве случаев лиофильная сушка
производится приблизительно при 200 К и давление 20-100 мПа. При более
низких температурах рекристаллизация льда уменьшается, но при этом
требуется более высокий вакуум и/или большее время сушки. Важно создать
конденсирующую поверхность для молекул воды, которые вышли из образца.
Это достигается с наибольшей эффективностью установкой на расстоянии в
несколько миллиметров от образца охлаждаемой жидким азотом ловушки,
однако может быть достаточно использования химических осушителей, таких,
как фосфорный ангидрид или один из цеолитов. Реальное время,
затрачиваемое на лиофильную сушку, очень сильно зависит от таких свойств
образца, как размер, форма, количество свободной и связанной воды и
относительные соотношения исходного и сухого веса. Процедуры сушки должны
разрабатываться для каждого образца, и важно, чтобы образец постепенно
достигал температуры окружающей среды в вакууме прежде, чем он будет
удален из аппарата для лиофильной сушки. До сих пор еще имеются
значительные разногласия относительно преимуществ метода лиофильной сушки
по сравнению с сушкой в критической точке. С учетом вышесказанного в
целом оказалось, что методом лиофильной сушки лучше сохраняются детали
клеточной структуры. Метод сушки в критической точке обеспечивает
получение большей информации об образце в целом. Хорошая демонстрация
результатов, полученных обоими методами, показана на рис. 11.23.
254
Глава 11
Рис. 11.23. Сравнение результатов, полученных-после сушки в критической
точке и лиофильной сушки замораживанием [377].
а и б - изображения лимфоцитов, высушенных в критической точке,
демонстрирующие тонкие микроворсиики и относительно гладкую поверхность,
лежащую под ними. Метки соответствуют 1 мкм [а) и 0,2 мкм (б); виг
показывают образцы после лиофильной сушки. Микроворсинки намного толще, а
поверхность клетки более сложная. Маркер составляет I мкм (в) и 0,2 мкм
(г).
Можно также высушивать ткани, прошедшие обезвоживание в этаноле или
ацетоне, а затем быстрое замораживание приблизительно до 163 К. Образцы
обезвоживаются в холодном растворе, а затем высушиваются при температуре
243-253 К и давлении от 1,0 до 0,1 Па. В работе [376] в деталях
описывается подробная схема, по которой образцы фиксируются,
обезвоживаются в этаноле, а затем постепенно замещаются фрео-ном-TF.
Далее холодный образец размещается на большом алюминиевом блоке, и оба
быстро замораживаются в жидком азоте. Охлажденный образец и металлический
блок помещаются в вакуумный эксикатор, и образец высушивается в вакууме
при давлении порядка 1 Па, во время чего металлический блок медленно
нагревается. Поскольку можно подвергать лио-
Препарирование биологических объектов для РЭМ
255
фильной сушке нефиксированную ткань, такая процедура вдвойне полезна тем,
что при этом получают образцы, пригодные для морфологических исследований
и для анализа. Так же как и для метода сушки материала в критической
точке, образцы после лиофильной сушки должны храниться в эксикаторе,
поскольку они могут легко поглощать воду.
11.3.8. Подложки для образцов
Одно из первейших соображений при выборе подложки состоит в том, что она
должна создавать некоторого рода проводящий мостик, так как даже наиболее
удачным образом покрытый металлом образец будет быстро заряжаться, если
будет электрически изолирован от столика микроскопа. Как обсуждалось
ранее, образец может быть уже закреплен на такой подложке, как стекло,
пластмасса, слюда, или на одном из мембранных фильтров. В этих случаях
необходимо только прикрепить подложку к объектодержателю, используя один
из видов проводящей краски, как, например, серебряная паста или
