Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
слоем, чтобы минимизировать нежелательный нагрев и предотвратить
возникновение локального заряда. Однако при условии, что образец
находится в хорошем контакте с подложкой, без процедуры покрытия в
основном обходятся тогда, когда образец должен анализироваться
рентгеновским спектрометром с дисперсией по энергии. Более высокие токи
образцов и более продолжительные времена счета, обычно необходимые для
анализа с кристалл-дифракционными спектрометрами, могут вызвать
необходимость нанесения покрытия на образец до того, как он будет помещен
в микроанализатор. Процедуры нанесения тонких слоев покрытий на образцы
рассматривались в гл. 10 и не будут здесь указаны.
Другими процедурами препарирования образцов для РЭМ, чем нанесение
покрытий, которое обсуждалось в гл. 11, обычно не пользуются для
анализируемых тканей. Работа при низком ускоряющем напряжении с целью
уменьшения эффекта зарядки не находит применения в практике
рентгеновского микроанализа, так как требуется выполнять условие, чтобы
ускоряющее напряжение было примерно в три раза больше, чем критический
потенциал возбуждения анализируемого элемента. Большинство приборов, в
которых анализируются срезы, работает при 20-50 кВ. Инфильтрация образца
такими химикатами, как
Препарирование биологических образцов для РМА
287
тиокарбазид или дубильная кислота, которые обладают сильным сродством с
металлическими носителями заряда, такими, как осмий, продолжительная
фиксация в четырехокиси осмия или в уранилацетате, а также заключительное
окрашивание солями серебра, золота или свинца, по всей вероятности, по
указанным ранее причинам не пригодны для микроаналитических методов
препарирования.
12.3. СПОСОБЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ ПРИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ
Многие, хотя и не все, проблемы, связанные со "стандартным"
препарированием образца, практически устраняются при выполнении процедур
с использованием низкотемпературных методик. Полезный обзор
низкотемпературных методик можно найти в сборнике статей Первой
международной конференции по микроскопии при низких температурах для
биологов, который недавно был издан в виде книги [333].
Криобиологические методики приобретают возрастающее значение в
рентгеновских аналитических исследованиях биологических объектов. Они,
вероятно, являются единственным способом, когда можно надеяться
проанализировать растворенные ионы и элементы. Криофиксация является
целиком физическим процессом и создает значительное механическое
напряжение на иную мягкую биологическую ткань. Превращение воды из
жидкого в твердое состояние останавливает физиологические процессы и
сильно уменьшает движение растворенных веществ. Вероятно, это
единственная процедура, в результате которой биологическая ткань
сохраняется в почти естественном состоянии. Дополнительные преимущества,
которые имеют место при работе с образцами при низкой температуре,
заключаются в заметном уменьшении скорости загрязнений и уменьшении
теплового повреждения образца под электронным пучком. В работе [277]
сделан обзор некоторых низкотемпературных методик, используемых в
растровой электронной микроскопии,, многие из которых пригодны для
рентгеновского микроанализа. Необходимо также сделать ссылки на обзоры
[427, 201] и книги [387, 320, 388, 205], каждая из которых содержит много
статей, описывающих низкотемпературные методики. Теперь криобиологические
процедуры будут рассмотрены в порядке их применения в процессе
препарирования.
12.3.1. Предварительная обработка образца
Фиксация. Вероятно, нецелесообразно производить фиксацию в любом виде,
так как теперь совершенно ясно, что даже, по-видимому, самая осторожная
фиксация может вызвать огром-
288
Глава 12
Таблица 12.2. Относительные массовые фракции элементов, полученные на
срезах, замороженных в гидратированном состоянии и вырезанных из
различных областей вдоль корня Lemna minoЧ
Морфологическая область корня Неупорядоченная меристема корня
Меристема корня Меристема корня Корень, прошедший дифферен-
цировку
Расстояние от кончика, 40-50 50-60 60-80 120-150
мкм
Фосфор 0,93+0,132> 1,46+0,06 3,66+0,15 1,16+0,12
(12) (9) (17) (12)
Сера 1,63+0,28 0,25±0,02 0,59+0,03 0,44+0,11
(12) (9) (17) (12)
Хлор 1,60+0,23 0,21±0,02 0,45+0,03 1,31+0,10
(13) (9) (17) (12)
Калий 3,95+0,66 2,06±0,06 5,71+0,25 8,49+0,41
(13) (9) (17) (12)
Кальций 0,34+0,05 0,06+0,01 0,23+0,04 0,37+0,09
(13) (9) (17) (12)
*) Анализ проводился на клетках кольца луба, подобных приведенным на рис.
12.7, д и е. Изменения концентраций элементов могут быть связаны с
изменениями при диф-ференцировке клеток лубяиой паренхимы.
2) ± означает среднюю квадратичную ошибку. Анализ в каждой области
проводился на двух или трех срезах.
ные изменения проницаемости мембраны. Если необходимо использовать
фиксацию для сохранения морфологии, то целесообразно параллельно
проводить исследования, в которых одна половина образца подготавливается
для изучения деталей морфологии, а другая половина -для анализа.
