Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
является хорошим примером такого типа скоростного охлаждения.
2. Струя жидкого пропана при температуре 83 К может быстро поливать
неподвижный образец [438].
3. Микрокапли клеток в виде суспензии могут распыляться на холодную
поверхность [439].
4. Образцы могут погружаться механически или вручную в плавящийся
криагент, такой, как один из фтористых углеродов, азот, изопентан и т. д.
Первые три метода использовались с образцами малых размеров, обычно на
одиночных клетках или очень маленьких кусочках ткани и, как следует из
изображений, полученных травлением в замороженном состоянии, достигались
очень высокие скорости охлаждения. В большинстве случаев биологический
микроанализ при низких температурах выполнялся на кусочках тканей больших
размеров (1-3 мм3), которые часто разрезались или разламывались после
быстрого охлаждения. При таких обстоятельствах сомнительно, что первые
три метода ох-
292
Глава 12
лаждения обладают преимуществом по сравнению с хорошо разработанными
методами погружения образца в жидкий кри-агент. На рис. 12.8 показан
пример устройства, которое было использовано для быстрого введения
маленьких образцов ткани в жидкий криагент. Аналогичное устройство было
описано в i[440].
Образец должен быть как можно меньше при сохранении физиологической
активности, и как можно больше должно быть удалено поверхностных
жидкостей, по возможности без нарушения баланса внутренних электролитов
клеток. Несмотря на то что в литературе имеется много данных по скоростям
замораживания для различных охлаждающих смесей, следует помнить, что эти
скорости были измерены термопарами, размеры которых много меньше, чем
образец, который мы пытаемся охладить. Хотя измеренные скорости
охлаждения для охлаждающих смесей являются полезным индикатором, лучшей
мерой эффективности данного охлаждающего режима является размер
кристаллов льда, а следовательно, величина повреждений и
перераспределения элементов в анализируемой части образца. Даже при
ступенчатом охлаждении любой образец диаметром более 250 мкм мог бы
перейти в стекловидное состояние на внешней поверхности, в то время как в
центре его могли бы находиться кристаллы льда.
В большинстве случаев при рентгеновском микроанализе биологических
объектов, вероятно, наиболее адекватным является охлаждение образцов в
затвердевающем азоте (63 К), монофтортрихлорметане (84 К) или 8%-ном
метилциклогексане в изопентане (100 К). Если проверить микроанализ на
хлор замороженных в гидратированном состоянии образцов, то, вероятно,
лучше избегать фтористых углеродов, так как следы галогена могут остаться
в замороженном образце.
Как только ткань заморожена, важно, чтобы она хранилась либо в жидком
азоте, либо оставалась при как можно меньшей температуре во избежание
рекристаллизации льда. В чистой воде рекристаллизация льда может
происходить при 143 К, хотя в биологических системах имеется очень мало
доказательств роста кристаллического льда вплоть до температур свыше 173
К- В недавно опубликованной статье [441] показано, что отсутствие
внутриклеточного замораживания во время охлаждения не является гарантией
того, что вымораживание не произойдет во время нагревания. В тканях,
медленно нагревавшихся после замораживания до 77 К, внутриклеточный лед
сначала появлялся при 188 К, и считается, что это явление связано с
расстекловыванием, так как обширная мигрирующая рекристаллизация (и
повреждение клетки) не происходила вплоть до 208 К.
Препарирование биологических образцов для РМА_______________293
Рис. 12.9. Замороженный срез печени мыши, на котором видны многочисленные
маленькие прозрачные для электронов кристаллы льда, наблюдаемые в
просвечивающем растровом режиме.
Можно различить основные фрагменты гепатоцитов (ядро и цитоплазму).
Маркер соответствует 1 мкм.
Очень мало известно о том, может ли процесс замораживания влиять на
результаты рентгеновского микроанализа. По мере охлаждения ткани фронт
замораживания проходит через образец, а кристаллы льда образуются из
чистой воды за счет клеточных жидкостей. При изучении замороженной в
гидратированном состоянии ткани (см., например, рис. 12.9) обнаруживаются
кристаллы льда различных размеров. Несомненно, что растворимые элементы
устремляются к краям кристаллов льда или прикрепляются к макромолекулам,
которые в большом количестве имеются в цитоплазме. Было бы неверным
предположить, что растворимые элементы не движутся, потому что сам
процесс замораживания должен вызвать некоторое перемещение. В процессе
образования льда в клетке имеется определенный период времени, когда
вместе присутствуют как жидкая, так и твердая фазы воды. В это время
концентрация электролитов в жидкости будет значительно возрастать и
вызывать изменения электрохимических градиентов в мембранах, которые в
свою очередь могут привести к некоторому увеличению ионного
перераспределения. Этот процесс протекает более интенсивно
294
Глава 12
в клетках и тканях с большими занятыми водой полостями, поэтому
