Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
233 3,4-10-3 4,8 мин 13
213 2,3-Ю-4 72 мин 2,6
193 8,3-10-" 33,5 ч 0,052
173 5,0-10~7 20 дней 1,3-ю-3
замороженной эвтектической смеси. Фаза льда состоит главным образом из
несвязанной воды, которая является важной частью всех биологических
систем, в то время как биологическая матрица состоит из гетерополимеров,
которые соединяют живую материю с изменяемым количеством связанной воды.
С помощью стандартных методов лиофильной сушки можно легко удалить
несвязанную воду, но гораздо труднее удалить связанную воду, которая
неизбежно составляет основу биологических полимеров - белков, углеводов и
нуклеиновых кислот.
Сублимация водяного пара из чистых кристаллов льда в эвтектической смеси
происходит тогда, когда парциальное давление водяного пара замороженной
поверхности больше, чем атмосферное давление у поверхности. Скорость
сублимации кристалла льда является лишь функцией температуры. В табл.
12.3 показано, как эта скорость изменяется в диапазоне температур 173-273
К- Следует помнить, что во время лиофильной сушки образец может хорошо
охладиться при сопутствующем уменьшении скорости сублимации льда из-за
отвода скрытой теплоты испарения. Однако обычно достаточно теплоты за
счет лучеиспускания и теплопроводности от оборудования и окружающей
среды, уравновешивающих эффекты охлаждения при сублимации воды.
Имеется целый ряд различных приборов для лиофильной сушки. Приведем
основные черты этих приборов:
1. Имеется камера сушки с охлаждаемым столиком. Он должен находиться при
достаточно низкой температуре во избежание рекристаллизации льда, если во
время охлаждения происходит остекловывание, и для предотвращения роста
кристалла, если при охлаждении образуются лишь маленькие кристаллы льда.
Камеру можно заполнять сухим инертным газом, например азотом. В некоторых
случаях полезно иметь запорный кран для пропускания жидкой смолы в камеру
для инфильтрации высушиваемого образца.
2. Вакуумная система должна обеспечивать давление в камере от 10 до 100
мПа. При высоком вакууме средняя длина
Препарирование биологических образцов для РМА
297
свободного пробега молекул сублимирующей воды возрастает, а теплопередача
между тканью и поверхностью, на которой происходит конденсация, достигает
минимального значения. Обычно вакуум достигается с помощью диффузионного
и механического форвакуумного насосов, хотя, если лиофильная сушка
производится при более высоких температурах, диффузионный насос может и
не понадобиться. В вакуумпроводе должна иметься либо химическая, либо
охлаждаемая ловушка для водяного пара.
3. В системе необходимо поддерживать высокий градиент водяного пара на
границе твердой фазы. Это лучше всего достигается с помощью молекулярной
дистилляции водяного пара на охлаждаемой жидким азотом ловушке внутри
камеры, поскольку 1 см2 поверхности при 77 К осаждает водяной пар со
скоростью 15 л/с.
Как альтернативное решение можно использовать химические осушители,
такие, как фосфорный ангидрид, или один из цеолитов, но они не столь
эффективны, как ловушка, охлаждаемая жидким азотом. Важно, чтобы
охлаждаемая ловушка находилась при температуре по крайней мере на 20°
холоднее, чем образец. Чем выше разность температур между высушиваемым
образцом и -конденсатором, тем более эффективно удержание водяного пара
от образца. Расстояние между высушиваемым образцом и ловушкой для
водяного пара должно быть меньше, чем длина свободного пробега молекул
остаточного водяного пара. В табл. 12.4 приведена длина свободного
пробега молекул воды в воздухе при различных давлениях.
Таблица 12.4. Средняя длина свободного пробега молекул воды в воздухе при
разной степени вакуума
Давление, Па Средняя длина свободного пробега
13 500 мкм
1,3 5 мм
0,13 50 мм
0,013 500 мм
1,3-ю-3 5 м
1,3-10-4 50 м
Скорость сушки зависит от многих факторов, в том числе от температуры,
размера и формы образца, относительных количеств связанной и свободной
воды в нем и в некоторой степени от вакуума в камере. Самым большим
препятствием для быстрого высушивания является сам образец, и в частности
со-
298
Г ласа 12
противление высушиваемой оболочки. Ткани сохнут от наружной оболочки
внутрь образца, и молекулы воды, сублимирующие внутри образца, перед
попаданием в вакуум должны проходить через высушенные участки, занятые
кристаллами льда. Эта сухая органическая оболочка утолщается по мере
того, как фронт сушки движется сквозь образец, и оказывает все большее и
большее сопротивление молекулам воды, которые испытывают большое число
соударений, прежде чем достигнут поверхности. В табл. 12.3 приведены
некоторые цифры для скоростей высушивания чистого кристаллического льда
при различных температурах. Эти скорости больше для остеклованного льда,
но значительно меньше для льда, внедренного в биологическую матрицу.
Температура, при которой должна происходить сушка, является весьма
спорным вопросом. Если образец находится при низкой температуре, то
