Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
вакуума, а система работает благодаря высокой поглощательной способности
молекулярного сита, которое при 77 К может создавать вакуум, равный 6,5
нПа.
12.3.7. Замораживание-замещение
Замораживание-замещение является полезным методом препарирования образцов
для получения тонких срезов. Несмотря на то что основное усилие
исследований было направлено на защиту морфологической целостности
образцов, в настоящее время имеется достаточно оснований, чтобы
предполагать, что замораживание-замещение может также быть полезным
методом препарирования для микроанализа биологических объектов. Мы
отправляем читателя к недавно опубликованным обзорам [453, 454], в
которых обсуждается целый ряд методов в применении для растительных и
животных тканей.
Процедура представляет собой относительно медленный процесс и состоит
просто в замене льда в быстро замороженном Образце безводным
растворителем при низкой температуре с последующей низкотемпературной
инфильтрацией ткани соответствующей заливочной средой. Все замещение,
инфильтрация смолой, полимеризация и изготовление срезов должны
выполняться в строго безводных условиях и при низких температурах. Эти
требования могут создать технические трудности, так как пар атмосферной
воды очень быстро поглощается осушителями при низкой температуре. По этой
причине изменения и перенос производятся либо в перчаточном боксе с сухим
азотом при небольшом положительном давлении, либо в герметических
контейнерах с люками для ввода и вывода.
Для большей эффективности замораживание-замещение должно производиться
при температуре ниже температуры рекристаллизации льда, которая для
большинства биологических тканей лежит в пределах от 163 до 193 К.
Использовался ряд органических жидкостей, а температуры и времена
замещения даны в табл. 12.5. Как и в случае лиофильной сушки, не могут
быть указаны точные времена, и необходимо для различных образцов
варьировать процедуры. Времена, приведенные в табл. 12.5, являются
средними для образцов размером 1-• 2 мм3, а температуры представляют
температурный диапазон проведения замещения. С целью сохранения структуры
объекта в замещающую жидкость могут быть добавлены такие фикса-
Препарирование биологических образцов для РМА
303
Таблица 12.5. Органические растворители, используемые при замораживании-
замещении
Замещающая жидкость Температура, К Время, дни Литературные ссылки
Ацетон 200-233 3-4 [4551
Ацетон + акролеин 190-233 1-2 [483]
Бутанол 193-233 Более 14 -
Диэтиловый эфир 200-233 20 [455]
Диэтиловый эфир и акролеин 163-233 6-20 [484]
Диметиловый эфир 158-233 28 ¦-
Этанол 200-233 3-4 [455]
Метанол 178-243 1 [482]
Пропанол 193-233 Более 14
Окись пропилена 200-273 10-15 [239]
торы, как 0s04 или уранилацетат, но присутствие тяжелого металла может
серьезно исказить аналитические измерения.
Чем ниже температура замещения, тем продолжительнее время замещения, что
делает в какой-то мере нереальным использование бутанола, пропанола,
диэтилового и диметилового эфиров. Как было показано рядом
исследователей, потери элементов существенно уменьшаются при более низких
температурах. Наиболее распространенным является использование либо
этанола и метанола, либо ацетона. Типичная процедура замещения дана в
[455] и описывается ниже.
Небольшие кусочки ткани, помещенные в корзиночку из проволочной сетки,
быстро замораживаются в жидкой смеси 8%-ного метилциклогексана в
изопентане, охлажденной до температуры 100 К в жидком азоте. Замороженные
образцы переносятся в безводный ацетон при температуре 193 К, и холодный
ацетон меняется каждый день в течение 3 или 4 дней. Удобно использовать
стеклянные бутылочки 20X50 мм со съемными пластиковыми крышками, так как
они легко удаляются даже при низкой температуре с помощью ключа для
откупоривания бутылок. Удобно также хранить бутылочки в отверстиях,
проделанных в большом металлическом блоке, так как за счет этого
обеспечивается большая тепловая масса, когда бутылочки вынимаются из
холодильника во время переноса. Наиболее удобным сушильным агентом для
замещающей жидкости являются гранулы молекулярного сита Linde ЗА или 4А.
Они могут быть высушены нагреванием до температуры около 900 К в вакууме
с последующим их охлаждением в инертной сухой атмосфере. Стеклянные
бутылочки заполняются наполовину высушенным молекулярным ситом, а затем
заполняются безводной замещающей жидкостью. Во время переноса, который
выполняется в перчаточном боксе под давлением сухого азота, контей-
304
Глава 12
неры, изготовленные из сеточки, могут быть быстро и удобно перенесены из
одной бутылочки в другую без образовавшегося на их поверхности льда.
После замещения при 193 К образцы медленно нагреваются до 233 К в течение
4 ч, а затем переносятся в свежий безводный ацетон при 233 К. Только что
высушенные образцы постепенно заполняются смолой в ацетоне в возрастающих
концентрациях, такой, как обладающая низкой вязкостью среда Спур-ра, в
которой хлорсодержащая компонента DER 736 заменяется на DY064 [456].
