Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
рекристаллизация уменьшается, но время сушки становится нереально долгим.
Тем не менее маленькие образцы, такие, как одиночные клетки,
первоначально высушивались замораживанием при 173 К, после чего в течение
трехнедельного периода температура постепенно повышалась. Сушка при более
высокой температуре повышает риск рекристаллизации льда, но приводит к
более быстрому удалению воды, и это является более приемлемым с
практической точки зрения подходом. Лиофильная сушка при более высоких
температурах также повышет риск "разрушения" (коллапса) растворимой
матрицы с сопутствующей потерей структурной целостности образца. Явление
коллапса характерно для многих водных растворов, и наилучшим образом его
можно избежать лишь при лиофильной сушке маленьких образцов при низких
температурах [444]. Парадоксальной здесь является большая вероятность
коллапса при тонкой структуре замороженных областей- той структуре,
которая нам нужна, но которую редко получают при быстром охлаждении
биологической ткани. В большинстве процессов лиофильной сушки
замораживание производится в интервале температур между 213 и 203 К, и
при таких условиях монослой клеток высыхает в течение нескольких часов, в
то время как высушивание кусочка ткани толщиной в несколько миллиметров
может занять несколько дней. Хотя не существует единственного режима
лиофильной сушки, который можно было бы одинаково хорошо применять ко
всем образцам, имеется целый ряд практических рабочих соображений,
которые могут быть использованы для всех образцов.
Образцы должны быть как можно меньше и, насколько это возможно, должно
быть удалено как можно больше воды. Оба этих требования накладывают
жесткие ограничения на образец, и часто бывает затруднительным удалить
поверхностный слой
Препарирование биологических образцов для РМА
299
воды из водяных образцов, не вызвав необратимого повреждения образца.
Если образец необходим лишь для морфологических исследований, то полезно
использовать предварительную фиксацию в одном из органических альдегидов.
Такая обработка помогает связать и укрепить биологическую матрицу и
уменьшает количество повреждений под действием кристаллов льда.
Проникающие криопротектанты не следует использовать, потому что, хотя эти
вещества уменьшают величину кристаллитов льда, они обладают гораздо
меньшей летучестью, чем вода, и их очень трудно удалять в процессе сушки.
Непроникающие криопротектанты, однако, являются самыми полезными, так как
легко отдают воду в процессе высушивания и образуют стабильную матрицу
вокруг образца. Для образцов, подлежащих анализу, не должны
использоваться ни фиксация, ни проникающие криопротектанты. Непроникающие
криопротектанты могут использоваться при последующем микроанализе,
поскольку, как оказалось, они не вызывают существенного перераспределения
электролитов.
При быстром замораживании образцов важно быть уверенным, что образец не
плавает на поверхности жидкого охлаждающего вещества. Эта проблема обычно
не возникает при изучении образцов больших размеров, а маленькие образцы
необходимо помещать в перфорированные контейнеры или держать их
маленькими щипчиками и погружать под поверхность. Очень мелкие частицы
материи, например одиночные клетки, могут быть либо разбрызганы на
холодную поверхность, либо осаждены на тонкие металлические фольги перед
быстрым замораживанием. Будучи замороженными, образцы как можно быстрее
должны быть перенесены на платформу аппарата для лиофильной сушки. Это
достигается наилучшим образом при помещении образцов в мелкую
металлическую тарелку глубиной около 5 мм, которая может быть заполнена
жидким азотом. Тарелка с находящимися в жидком азоте образцами быстро
переносится на предварительно охлажденный столик в камеру для лиофильной
сушки, заполненную сухим азотом. Как только азот выкипит, камеру можно
откачать до рабочего вакуума. Эта процедура уменьшает образование
кристаллов льда на поверхности образца, которые при некоторых
обстоятельствах могут скапливаться и вызывать перераспределение элементов
внутри образца. Несмотря на то что невозможно установить строгое и
определенное правило для определения времени и температуры сушки,
последняя должна производиться при как можно более низкой температуре в
соответствии с размером и формой образ*' ца и возможностями
экспериментальной системы. В процессе сушки обычно постепенно повышают
температуру образца. Это
300
Гласа 12
необходимо производить медленно, иначе вода, содержащаяся в образце,
может начать таять и вызвать перераспределение электролитов. К концу
процесса сушки температура образца должна быть на несколько градусов выше
температуры окружающей среды, в то время как в камере поддерживается все
еще высокий вакуум. Это будет гарантией того, что последние остатки
свободной воды сублимируют из образца. Как только температура образца
достигнет температуры окружающей среды, удобно начать нагрев конденсатора
и/или удалить образец с конденсатора. Самое важное быть уверенным в том,
