Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
образование кристаллического льда может быть более быстрым в межклеточном
пространстве, чем внутри клеток, что приводит к возрастанию концентрации
электролита в межклеточных фрагментах. Чем быстрее происходит
замораживание, тем меньше могут продвинуться электролиты от их исходного
положения в клетке (растворимые ионы чрезвычайно подвижны в клетке).
12.3.3. Движение элементов внутри данного клеточного фрагмента
В настоящее время это может не иметь очень большого значения для
рентгеновского микроанализа, так как большая часть исследований
проводится на локализованных элементах внутри и вне естественных
фрагментов клетки, как на ядре (рис. 12.9), где, по-видимому, рост
кристаллов льда ограничивается клеточными мембранами. Рост кристалла льда
является проблемой, когда исследования проводятся по определению
распределения и концентрации элементов внутри клеточного фрагмента.
Является сомнительным, можно ли возложить большие надежды на
аналитические результаты, полученные из различных областей внутри данного
клеточного фрагмента из замороженных тканей, в которых легко видны
кристаллы льда.
12.3.4. Процедуры после замораживания
Как только произошло замораживание ткани и клеточные жидкости
иммобилизированы, открывается много возможностей как в отношении
дальнейшей обработки ткани, так и в вопросе ее непосредственного
исследования и анализа.
12.3.5. Замороженный в гидратированном состоянии и частично замороженный
в гидратированном состоянии материал
При условии, что микроскоп или рентгеновский микроанализатор оснащены
приставкой для охлаждения, в нем можно исследовать и анализировать
массивные образцы и срезы, в которых некоторая часть или вся вода
находится в твердом состоянии. Эти исследования связаны с большими
техническими трудностями, не последней из которых является уверенность в
том, что образец остается в замороженном из гидратированного состояния в
незагрязненном виде в течение всего процесса препарирования и проведения
исследований. Объем книги не позволяет подробно обсудить эти методики,
поэтому мы даем
Л репарирование биологических образцов для РМА
295
ссылки на недавно опубликованные обзоры [277, 201], в которых приводятся
как разумное объяснение рентгеновского микроанализа замороженных в
гидратированном состоянии образцов, так и подробности некоторых
разрабатываемых в настоящее время методов.
12.3.6. Лиофильная сушка
Метод лиофильной сушки заключается в сублимации льда из клеток и тканей в
вакууме и, таким образом, является важным способом препарирования для
микроанализа биологических объектов. Этот способ отнюдь не является
идеальным, и необходимо находить компромиссное решение проблем, связанных
с неизбежным образованием и ростом кристаллов льда и с преимуществом,
заключающимся в том, что имеется возможность избежать контакта ткани с
любыми химикатами во время процесса препарирования. Более того, это не
самый лучший способ для всех образцов. Оптимальная сохранность получалась
только на образцах, в которых оставалась матрица ткани после завершения
процесса сушки. Метод лиофильной сушки в сочетании с микроаналитическими
исследованиями, вероятно, лучше всего применим к средам материалов,
клеточным монослоям, изолированным клеткам и тонким жидким образцам.
Высушенные в замороженном состоянии массивные материалы могут быть
заполнены воском или смолой, и заполимеризовавшийся материал может
нарезаться. Для анализа' массивных объектов, по-видимому, лучше не
использовать высушенные в замороженном состоянии объекты из-за
возрастания размера области генерации рентгеновского излучения [295].
Метод лиофильной сушки, вероятно, не является наилучшим методом
препарирования для анализа in situ межклеточных жидостей - такие
исследования более правильно проводить при замораживании из
гидратированного состояния. Метод лиофильной сушки биологических образцов
для микроскопии и анализа является в общем эмпирическим процессом, и
невозможно выработать правила, которые были бы применимы ко всем
образцам, - для каждого образца требуется своя собственная процедура.
Такие процедуры, вероятно, лучше описать после рассмотрения некоторых
физико-химических аспектов замораживания и лиофильной сушки. Поэтому
предлагается сначала рассмотреть некоторые теоретические аспекты
лиофильной сушки и перейти к обсуждению некоторых практических аспектов,
применимых ко всем образцам. Несмотря на то что о методе лиофильной сушки
было уже много написано, недавно опубликованные статьи {442-445] содержат
строгую теоретическую основу метода.
Замороженный биологический образец состоит из смеси чистой воды (льда) и
биологической матрицы, так называемой
293
Глава 12
Таблица 12.3. Давление пара, скорость испарения и продолжительность
испарения кристаллического льда при различных температурах
Температура, К Максимальная скорость испарения, г/(см2-с) Время
испарения на I г/см2 Давление пара льда, Па
273 8,3-10-2 1,2 с 595
