Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
гранулярные осадки содержат как Na+, так и Са-Ы-.
приведены некоторые из осаждающих реагентов, которые ис-пользовались с
биологической тканью. Другими словами, если ион сам является тяжелым
элементом, то в качестве осаждающих агентов могут использоваться
органические реагенты. Тот же принцип может быть положен для
внутриклеточной локализации некоторых энзимов, продукты реакции которых
являются неорганическими ионами.
В работах [416, 414] был дан критический обзор методов осаждения для
диффундирующих веществ (табл. 12.1), а на рис. 12.6, взятом из работы
[417], приводятся способы применения этого метода для биологических
тканей. Важно, что специфичность реакции адекватно проверяется. Так,
метод осаждения органической соли серебра для хлорида будет также давать
осадок с бромидом, а широко используемая пироантимо-натная методика для
натрия приведет также к появлению осадка с калием, магнием, кальцием и
марганцем. В недавно опубликованной работе [418] приводится обзор
пироантимонатных методов осаждения и представлен ряд критериев, которые
полезно применять, когда этот метод используется для анализа
Препарирование биологических образцов для РМА
283
катионов. Важно знать величину потерь из образца в процессе
препарирования объекта. Авторы работы [419] сумели показать, что после
предварительной нагрузки ткани изотопом 36С1 утрачивается лишь около 4%
хлора в использующем серебро методе осаждения хлора. Необходимо учитывать
локализацию артефактов, происходящую до применения метода осаждения, в
процессе метода или после него. В работе [405] продемонстрировано, что
осажденный с помощью пироантимоната кальций исчезает из ткани в процессе
обезвоживания спиртом. Авторы работы i[420] сумели показать методом
рентгеновского микроанализа, что осажденные серебром осадки хлора были
относительно стойкими при последующей фиксации в осмии.
12.2.5. Обезвоживание
Так как образец в конечном итоге исследуется в микроскопе в вакууме, вода
либо должна быть удалена, либо давление ее паров должно быть уменьшено
понижением температуры образца. Нет сомнения в том, что химическое
обезвоживание приводит к потере легко диффундирующих веществ из клеток и
тканей, вызванной химической фиксацией. Хотя критические сравнительные
исследования не производились, оказалось, что не существует большой
разницы в воздействии этанола, метанола или ацетона в качестве
обезвоживающих реактивов. Однако в работе [421] было установлено, что в
растительном материале, обезвоженном диметоксипропаном, обнаружена
существенно лучшая сохранность ионов (Na+, К+, С1_) по сравнению с
обезвоживанием в ацетоне. Можно обойтись без классических процедур
обезвоживания, используя инертные процедуры обезвоживания, предложенные в
[422], водно-растворимые смолы, метод заливки в глутаральдегиде-мочевине
[423] или пропускание материала, прошедшего фиксацию в глутаральдегиде,
через глутаральдегид с возрастающими концентрациями вплоть до 50%, после
чего ткань переносится прямо в эпон-812 [404]. Другая процедура [424]
заключается в инфильтрации фиксированных образцов раствором
поливинилового спирта (MW 14 000) с возрастающими концентрациями вплоть
до конечной 20%-ной концентрации. Вода затем удаляется путем диализа, а
образовавшийся твердый гель связан поперечными связями с
глутаральдегидом. Однако оказывается, что эти процедуры незначительно
снижают потерю растворимых материалов из исследуемых образцов. Простая
сушка образца на воздухе также вызывает перераспределение элементов.
Таким же образом процедура сушки в критической точке, которая обычно
проводится в конце фиксации и обезвоживания, по всей видимости, приведет
к слабому различию в концентрации растворимых веществ, которые давно уже
были удалены в процессе
284
Глава 12
обезвоживания. Сушка в критической точке может оказывать существенное
влияние на связанные элементы, особенно когда в качестве переходной
жидкости используются фтористые угле-роды. Имеется, к сожалению, мало
результатов, позволяющих с определенностью судить о влиянии метода сушки
в критической точке на эффект растворимости. Процедура сушки испарением
растворителя, описанная в [425], может быть также полезной при
препарировании образцов, если можно было бы показать, что во время этой
обработки происходит минимальная экстракция элементов. В фиксированных и
химически обезвоженных образцах проводится замещение фреоном-113, а затем
они быстро помещаются в вакуум при давлении 1-10 Па. Начальная высокая
скорость испарения фреоиа-113 охлаждает оставшийся фреон, который
затвердевает и сублимируется с меньшей скоростью. Полное отсутствие воды
снимает проблему повреждения кристаллическим льдом, и получаются столь же
хорошие морфологические результаты, как и при сушке в критической точке.
12.2.6. Заливка
Большинство фиксированных и обезвоженных биологических тканей необходимо
заливать либо смолой, либо парафином, чтобы иметь возможность изготовить
