Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гоулдстей Дж. -> "Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1" -> 110

Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.

Гоулдстей Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., Лифшин Э. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 — М.: Мир, 1984. — 348 c.
Скачать (прямая ссылка): rastovayaelektronnayamicroskopiya1984.djvu
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 139 >> Следующая

Инкапсуляция. Если из образца будут изготавливаться срезы или изломы, то
может оказаться необходимой инкапсуляция в инертном веществе, растворимом
в физиологически совместимой жидкости. Инкапсуляция накладывает
дополнительные механические напряжения на образец при замораживании. Эта
процедура особенно важна для небольших мягких биологических образцов и
для растительного материала с его толстыми целлюлозными стенками. Типы
материалов, которые могут быть использованы, включают агар, сыворотку
бычьего альбумина, декстран, поливинилпирролидон, оксиэтилированный
крахмал в концентрации 10-30%. Наиболее важной является проверка того,
какое физиологическое воздействие эти вещества могут оказать на
функциональную активность исследуемой ткани.
Криозащита. Фактически невозможно заморозить любой, даже самый маленький,
кусочек биологической ткани без повреждения кристаллом льда в той или
иной форме. Такое поврежде-
Рис. 12.7. Замороженные в гидратированном состоянии и высушенные методом
лиофильной сушки срезы ткани корня Lemna, залитого полимерными
криопротектантами, нарезанные при температуре 200 К и исследованные при
113 К на столике с охлаждением растрового электронного микроскопа.
а, б - срезы лиофильной сушки, залитые в ПВП. Маркер соответствует 20
мкм; в, г --срезы лиофильной сушки, залитые в HBS. Маркер соответствует
100 мкм; д, е - срезы замораживания в гидратированном состоянии, залитые
в HES. Маркер соответствует 20 мкм (5) и 10 мкм (г).
230
Глава 12
ние может быть существенно уменьшено при замещении крио-протектантом в
образце перед замораживанием. Исследования показали, что обычно
используемые проникающие криопротек-танты, глицерин и диметилсульфоксид
хотя и обеспечивают хорошую структурную сохранность, но приводят к
огромному физиологическому повреждению клеток, и их не следует
использовать при микроаналитических исследованиях. Непроникающие
криопротектанты с высоким молекулярным весом, такие, как по-
ливинилпирролидон (ПВП) и оксиэтилированный крахмал (HES), могут
обеспечить хорошую сохранность морфологии, в тоже время приводя к
минимальным возмущениям функциональной физиологии ткани. В ряде статей
[428-433, 295] показано, что криопротектанты с высоким молекулярным
весом, по всей видимости, могут безопасно использоваться в сочетании с
рентгеновским микроанализом тканей. Это заключение подтверждается в
работе [434], в которой продемонстрировано, что растворы ПВП обеспечивают
эффективную криозащиту без ухудшения нормальных электрофизиологических
функций двигательной нейронной ткани лягушки. В недавно опубликованном
исследовании [435] ткани крысы показано, что использование таких
высокомолекулярных криопротектантов является практическим путем
препарирования материала для рентгеновского микроанализа диффундирующих
элементов. На рис. 12.7 показано морфологическое изображение, а в табл.
12.2 содержится соответствующая аналитическая информация, которая была
получена на корнях Lemna, инкапсулированных в ПВП и HES. Оба полимера
значительно уменьшают в клетках повреждение за счет кристаллов льда, а
также улучшают нарезку и излом инкапсулированных тканей. Очевидно, что
введение в образец искусственных центров кристаллизации может уменьшить
повреждение кристаллами льда. Эти вещества, например хлороформ, являются
весьма токсичными для клеток и не должны без учета этого обстоятельства
применяться в исследованиях, включая рентгеновский микроанализ.
12.3.2. Способы замораживания
Различные способы замораживания биологических материалов содержатся в
обзоре {436]. В работе [296] содержатся полезные физико-химические основы
способов замораживания биологических систем. Важный момент всех этих
методов состоит в том, что образец должен быть охлажден так быстро, как
это только возможно, хотя все еще продолжаются большие споры относительно
того, как наилучшим образом можно достичь этого быстрого охлаждения.
Существуют четыре основных способа, с помощью которых образцы могут быть
быстро охлаждены:
Препарирование биологических образцов для РМА
291
п
Отверстие для штифта ^
Рис. 12.8. Механическое устройство ввода объекта для быстрого
замораживания.
Стержень держателя образца вставлен в верхнюю трубку и удерживается в
определенном положении с помощью маленького штифта. Устройство
располагается над сосудом Дьюара, в котором находится жидкая криогенная
смесь, и крепежный шгифт вынимается. Получаемые скорости ввода объекта в
3-4 раза больше чем те, которых можно достичь при ручной подаче. Образец
легко освобождается от стержня, находясь уже в криогенной смеси.
Направляющая : шайба
J1
Положение отверстия для • --штифта в 5 вытянутом положении Верхняя --
трубка
- Пружина
е!
кожух
л.
•- Стержень патуни
• Образец
1. Образец может быть быстро прижат к материалу с высокой
теплопроводностью, находящемуся при низкой температуре. Метод с
использованием медного блока при температуре 4 К, описанный в [437],
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 139 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed