Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
В этой главе описало применение двух ^-векторов, пригодных для клонирования кДНК, — ^gtlO и A,gtll. Библиотека, клонированная в AgtlO, удобна для скрининга олиго- и поли-нуклеотидными зондами. В зависимости от цели исследования зондами могут служить клонированные фрагменты ДНК, суммарная геномная ДНК, синтетические олигонуклеотиды, соответствующие нужной последовательности аминокислот, '"РНК или кДНК. Второй вектор, ^gtll, представляет собой экспрес-сируюший вектор, который обеспечивает возможность синтеза
72 ______ Глава 2
0.00 5 53 19 42 22.37 27.61 29.49 32.47 36.Ь9 39.00 сб
0.44 22 45 30.49 32.71 V
23 15 33.61
23.97 33.67
34.74
гг St
* 3
¦X. X ? X = X 1 - X ^ос------ X *5 X
*3 = 1 1 1=51 S 1 0 с 8^5, Е 5 с .s.
•=? 1 Qaoat оа Оэ liyoaoaco со i 2
11 1 I 1 1 !i к i | I се
га
а
с
- Ь527 1 4«*l I
Рис. 1. Карта вектора XgtlO. Сайты рестрикции приведены с указанием расстояния (в т.п.н.) от левого конца вектора. Деления 6527 захватывает область ДНК между 49,1 и 57,4% (по карте фага X дикого типа). Замещение immiu включает последовательности ДНК между 72,9 и 79,3%.
полипептида, кодируемого ДНК-вставкой [1]. Библиотеки кДНК в Я-gtll можно, таким образом, скринировать с помощью антител, что позволяет выявлять клоны, кодирующие те антигены, против которых направлены эти антитела [2].
1.1. Xgt10
^gtlO (imm434b527) содержит уникальный сайт расщепления ?coRI, находящийся внутри гена ^-репрессора (карта ^gtlO приведена на рис. 1). Если считать, что максимальный размер пригодной для упаковки ДНК составляет 105% от длины генома фага дикого типа, максимальная длина вставки для ^gtlO составит 7,6 т.п.н. Как показано в работе Мюррея с соавт. [3], введение фрагмента ДНК в ген репрессора (cl) приводит к появлению с1_-рекомбинанта, образующего бляшки с прозрачным центром. Фаг с1+, например исходный вектор XgtlO, образует мутные бляшки. Таким образом, рекомбинантный с1_-фаг, содержащий вставку в сайте рестрикции ?coRI, можно легко отличить от родительского с1+-фага по морфологии бляшек. Мюррей разработал ряд ^-векторов, вставка в которые производится в область иммунности (immunity insertion vectors), что дает возможность визуального скрининга рекомбинантных фагов [3]. К этому семейству принадлежит и вектор ^gtlO.
Многие из ранее описанных векторов, в которых чужеродная ДНК вводится в область иммунности, например NM607, NM641, NM1149 и NM1150 [3, 4], можно использовать для клонирования относительно коротких фрагментов ДНК (например, кДНК). Шерер и др. [5] с успехом использовали А,-вектор NM641 red~ для получения библиотек кДНК. XgtlO был сконструирован для того, чтобы иметь легкоразмножающийся %-вектор, приспособленный для клонирования коротких фрагментов. Это свойство вектора придает ему важные преимущества, так как при упаковке стандартными методами в фаговые частицы, как правило, пакуются более длинные (близкие по длине к ДНК фага X дикого типа) фрагменты. Если, как это обычно
Конструирование библиотек в векторах AgtlO и Xgtll
73
бывает, эффективность упаковки in vitro зависит от размеров пакуемой ДНК, использование вектора A,gtlO позволяет увеличить выход клонированных коротких фрагментов ДНК примерно в 10 раз.
Так как длина вектора ^gtlO достаточна для упаковки и при отсутствии вставки, первичная библиотека в ^gtlO может содержать от 70 до 99% исходных, не несущих вставки фагов. Скрининг такой библиотеки — дело довольно трудоемкое. К счастью, эту трудность можно преодолеть, проведя селекцию против нерекомбинантных фагов в ходе амплификации библиотеки. В данном случае в качестве хозяина используют штамм Е. coli, несущий мутацию /г/7Л150 [7] (высокая частота лизо-генизации). При инфекции фагом kgtlO (или любым cl+tmm434) рост с1+-фаговых частиц подавляется настолько, что бляшки не образуются вообще. В то же время фаг с генотипом с1~ формирует бляшки на газоне таких бактерий успешно. Рассев клонированной в ^gtlO библиотеки кДНК на хозяине hflA 150 эффективно удаляет из нее родительский фаг. Сходные результаты были независимо получены Шерером с соавторами, которые высевали клонированные в red~ ^-векторе NM641 библиотеки на Е. coli, несущей мутацию 1ус7 (вероятно, аллельную локусу hfl) [5].
1.2. bgtll
Структура экспрессирующего вектора A,gtll (lacb cI857 tiiti5 S100) приведена на рис. 2. Для введения чужеродной ДНК используется уникальный сайт расщепления ?coRI, расположенный внутри гена lacZ на расстоянии 53 п. н. с б'-стороны от терминирующего кодона р-галактозидазы. Если считать, что максимальный пригодный для упаковки размер ДНК составляет 105% от длины ^-ДНК дикого типа, вектор A,gtl 1 способен принимать вставки величиной до 7,2 т.п.н. Фаг-вектор продуцирует температурочувствительный репрессор (с1857), неактивный при 42 °С. Кроме того, этот вектор несет amber-мутацию (5100), делающую его неспособным к лизису хозяйской клетки» не имеющей атбег-супрессора supF.
