Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
5. Приводимую ниже методику можно использовать для удаления очень коротких фрагментов ДНК (например, линкеров). Добавьте 0,1 объема 3 М ацетата натрия pH 6,0. Внесите 0,6 объема изопропанола, смешайте, проинкубируйте 15 мин на льду и осадите ДНК в микроцентрифуге при комнатной температуре в течение 5 мин [6]. Удалите надосадок и промойте осадок половинным объемом 40%-ного изопропанола в 0,3 М ацетате натрия pH 6,0. Подсушите осадок в вакуум-эксикаторе и растворите в нужном объеме ТЕ.
6. Определите точную концентрацию ДНК.
18.9. Определение оптимальных условий лигирования
1. Проведите лигирование аликвот донорной ДНК из фракций градиента, близких по длине к оптимальной длине вставки (например, от 15 до 25 т.п.н.) с постоянным количеством векторной ДНК- Упакуйте и оттитруйте (см. разд. 13.2) на подходящем штамме бактерий. Если условия частичного расщепления выбраны правильно, то максимум эффективности упаковки совпадает с фракциями нужного размера (~20 т.п.н. для векторов, описанных в разд. 15). Эффективность должна заметно спадать для фракций, размер которых больше максимально допустимого для вектора. Следует тщательно проверить, что для конструирования библиотеки не выбраны фракции ДНК, длина молекул которых близка к предельно допустимой (см. разд. 3.2). Соберите подходящие фракции.
2. Проведите лигирование различных количеств отобранной донорной ДНК с постоянным количеством векторной ДНК (при концентрации 100—150 мкг/мл), упакуйте и оттитруйте. Для препаратов векторной ДНК, центральный фрагмент которых удален или же способность его к лигированию нарушена фер-
5—196
66
Глава 1
ментативно, максимальная эффективность должна наблюдаться тогда, когда отожженные плечи векторов и фрагменты донорной ДНК. находятся примерно в эквивалентном соотношении. Так* если концентрация ДНК плеч вектора (~30 т. п. н.) составляет 100 мкг/мл, донорные фрагменты (средняя длина 20 т. п. н.) можно взять в концентрациях 15, 30, 60 и 120 мкг/мл (эквивалентному отношению соответствует концентрация 67 мкг/мл)'.
Если центральный фрагмент не удалялся (т. е. если применяется генетическая селекция против нерекомбинантных фагов), плечи фага при лигировании должны присутствовать в. молярном избытке, так как эффективность лигирования донорной ДНК будет расти асимптотически с увеличением отношения концентраций ДНК плеч и вставок [6]. Компромиссные условия реакции выбирают таким образом, чтобы эффективность была достаточной при не слишком большом расходе реагентов для лигирования.
Определенные таким образом условия реакции подходят для большинства случаев.
3. На всех стадиях проверки следует тщательно следить,, чтобы основные параметры, такие, как концентрация лигазы„ буферы, упаковочные экстракты, бактериальные штаммы, не менялись; липкие концы векторной ДНК необходимо отжигать» инкубируя эту ДНК в течение часа при 42 °С в присутствии 10 мМ MgCl2. Необходимо точно придерживаться инструкции по работе с упаковочными экстрактами. Для титрования фага следует выбирать культуральную среду, на которой образуются крупные, хорошо видимые бляшки (разд. 13.2). Если библиотеку предполагается размножить не на том штамме, на котором определялись оптимальные условия лигирования, предназначенный для размножения библиотеки штамм следует проверить на эффективность образования бляшек.
4. Для контроля поставьте реакции упаковки без добавления какой-либо ДНК и с добавлением расщепленной и лигированной «на себя» векторной ДНК. Концентрация ДНК должна быть той же, что и в пробной реакции. При проведении препаративной упаковки следует учитывать фон, появляющийся за счет недорасщепления вектора, загрязнения ДНК плеч вектора центральным фрагментом, а также вследствие ошибок системы Spi-селекции (разд. 14) либо присутствия фаговой ДНК в упаковочном экстракте. Вклад в фоновую гибридизацию некоторых из этих факторов можно оценить прямо, например проведя скрининг части библиотеки радиоактивным зондом, гомологичным участку центрального фрагмента вектора.
5. Сохраняйте пробные реакции до окончания конструирования библиотеки.
Каждую новую партию упаковочного экстракта следует проверить на эффективность, с которой происходит упаковка
Использование А-векторов для конструирования библиотек ДНК
67
«стандартной» Я-ДНК, например, используемого вектора. Для пробных экспериментов, однако, не обязательно использовать экстракты с наивысшей эффективностью.
18.10. Подробная методика гибридизационного скрининга
1. Для скрининга как с высокой, так и с низкой плотностью рассейте фаг и убедитесь, что бляшки невелики и гомогенны по размеру (разд. 13.2). Не используйте недавно залитые (влажные) чашки; готовьте верхний слой на агарозе, а не агаре. Инкубируйте чашки в перевернутом положении. После появления бляшек перенесите чашки в холодильник (4°С) не менее чем на час. Это позволяет избежать отделения верхнего слоя при снятии с чашки фильтра. Фильтры-реплики можно получать даже с чашек, хранившихся в течение нескольких недель.
