Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
3. ДНК-лигаза Т4, выделенная из клеток Е. coli El 150 по методу [11], либо фирмы New England Biolabs.
4. Нуклеаза SI — фирмы Boehringer Mannheim Biochemicals.
5. Рестриктаза ?coRI, выделенная из клеток Е. coli RY13 по методу [15], либо фирмы New England Biolabs.
6. Метилаза ?coRI, выделенная из клеток Е. coli RY13 по методу [16], либо фирмы New England Biolabs.
7. Полинуклеотидкиназа Т4 — фирмы Pharmacia P-L Biochemicals, Inc.
Приведенные здесь методы выделения ферментов не обязательно лучшие. Могут быть использованы и другие методы, и продукция других фирм.
2.2. Другие реагенты
1. 2'-Дезоксинуклеотид-5'-трифосфаты (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)—фирмы Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Приготовьте концентрированные растворы нуклеозидтрифосфатов в стерильной дистиллированной воде, доведите с помощью NaOH pH до 7—8 и храните при —70 °С. Точную концентрацию нуклеотидов определите спектрофотометрически.
_________Конструирование библиотек в векторах AgtlO и Xgtll__79
2. Аденозин-б'-трифосфат, динатриевая соль — фирмы Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Приготовление исходного раствора описано в пункте I.
3. Oligo(dT) 12-18 — фирмы Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Растворите в стерильной дистиллированной воде в концентрации 100 мкг/мл и храните при —70 °С. Точную концентрацию определите спектрофотометрически.
4. Б-Аденозил-Ь-метионина иодид, grade I фирмы Sigma Chemical Company. Приготовьте 10 мМ исходный раствор в 10 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,0 и храните при — 20 °С. Перед использованием разбавьте в 100 раз (до 100 мкМ) дистиллированной водой.
5. Линкеры ?coRI. 5/-OH-d(GGAATTCC) фирмы Collaborative Research, Inc. Приготовьте исходный раствор 500 мкг/мл в 10 мМ трис-НС1 pH 7,5, 1 мМ Na3 ЭДТА и храните при —20 °С.
6. Дезоксицитидин 5/-[а-32Р]трифосфат, 10 мКи/мл, ~800 Ки/ммоль, водный раствор — фирмы Amersham.
7. Аденозин-5/-['^-32Р]трифосфат, 10 мКи/мл, >3000 Ки/ /ммоль, водный раствор — фирмы Amersham.
8. Изопропил-р-О-тиогалактопиранозид (IPTG) — фирмы Sigma Chemical Company. Приготовьте 1 М раствор в стериль-яой дистиллированной воде и храните при —20 °С.
9. 5-Бромо-4-хлоро-3-индолил-р-0-галактопиранозид (XGal) — фирмы Boehringer Mannheim Biochemicals. Приготовьте раствор с концентрацией 40 мг/мл в диметилформамиде и храните при —20 °С.
10. Био-Гель А50т, 100—200 меш — фирмы Bio-Rad Laboratories. Реагенты 8 и 9 нужны только для клонирования в ^gtll.
2.3. Штаммы бактерий и фагов
2.3.1. Штаммы для клонирования в XgtIO
1. BNN93=?. coli hsdR- hsdM+ supE thr leu thi lacYl tonA2\.
2. BNN102=BNN93 hflAl50 [chr:: ТпЮ]. Конструирование BNN102 описано в работе [1].
3. kgtl0=KsrIxr Ь527 srlK3° imm434 (s/7434+) srIK4° srl'Kb0. ^gtlO сконструирован in vitro с использованием левого плеча NM518 [17] и правого плеча NM607 [3]. Равные массы ДНК NM518 и NM607 были смешаны, расщеплены Xhol, лигированы лигазой Т4 и упакованы in vitro. Одна четверть полученных фагов должна была содержать нужный генотип. Фаговая ДНК была отобрана по рестриктной карте.
80
Глава 2
2.3.2. Штаммы для клонирования в
1. BNN97=BNN93 (A-gtll). Генотип A,gtll—lacb A {shindlim—3) sril3° cl857 srl%4° nin5 crlX5° SamlOO. Конструирование Xgtll описано в работе [1].
2. Y1088=.E. coli AlacU 169 supE supF hsdR~ hsdM+ metB trpR tonA2\ proC :: Tn5 (pMC9). pMC9=pBR322-/ac/Q.
3. Y1089=?'. coli AlacU 169 proA+ ДIon araD 139 strA hflA 150 [chr:: TnlO] (pMC9).
4. Y1090=?. coli AlacU 169 proA+ Alon araD 139 sir A supF[trpC22:: TnlO] (pMC9).
Конструирование Y1088, Y1089 и Y1090 описано в работе И; Штаммы, необходимые для клонирования в Xgtll, имеются в Американской коллекции типовых культур (American Туре Culture Collection). У Clontech Laboratories можно получить несколько рекомбинантных библиотек в A,gtll и положительные контроли для иммуноскрининга. Расщепленные ?coRI и дефос-форилированные плечи Agtll продает фирма Promega Biotec.
2.4. Выращивание фаговых векторов и выделение векторной ДНК
2.4.1. Приготовление клеток для газона
Для рассева фага приготовьте клетки BNN93, BNN102 а Y1088 так, как описано в работе Дэвиса и соавт. [11]. Нарастите клетки до стационарной фазы в среде LB (pH 7,5), содержащей 0,2% мальтозы. Клетки осадите и ресуспендируйте в 10 мМ MgCb С/г исходного объема культуры). Храните при
4 °С. Для рассева библиотеки используйте свежеприготовленные клетки.
2.4.2. Размножение kgtIO
Описанная ниже методика сводит к минимуму число фаговых частиц в препаратах вектора, образующих прозрачные бляшки. Отдельные препараты фага получают из индивидуальных бляшек и титруют. Тот из них, который при рассеве дает наименьшее число прозрачных бляшек, отбирают для получения в высоком титре. Для приготовления векторной ДНК не следует выбирать фаголизаты, дающие при рассеве более одной прозрачной бляшки на 104, так как это приводит к появлению в библиотеке ложных рекомбинантов.
