Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Использование А-векторов для конструирования библиотек ДНК
59
фосфатазой препарат донорной ДНК (например, геномную ДНК после рестрикции ?coRI) с препаратом расщепленной и обработанной фосфатазой плазмиды (например, pBR322, рестрици-рованной ?coRI). После лигирования донорной ДНК с плазмидой, обработанной фосфатазой, выход устойчивых к ампициллину трансформантов должен резко возрасти.
Убедитесь, что количество проверенного фермента достаточно для конструирования библиотеки.
18.4. Выделение высокомолекулярной хромосомной ДНК из клеток эукариот
Этот метод представляет собой модификацию метода, описанного в работе [27].
1. ДНК с наибольшим молекулярным весом получают из свежих живых клеток или тканей. Если клетки нельзя обработать немедленно, следует быстро заморозить их в жидком азоте (N2) и сохранить при —70 °С. Перед замораживанием крупных кусков тканей измельчите их ножницами. Это ускоряет замораживание ткани и облегчает последующую обработку (стадия 2).
2. Охладите ступку и пестик жидким азотом. Налейте в ступку жидкий азот и добавьте препарат ткани (1—2 г). Не давая жидкому азоту испариться, разотрите препарат охлажденным пестиком в мелкий порошок.
3. Небольшой кисточкой (охлажденной в жидком азоте) перенесите порошок из ступки в охлажденный во льду гомогенизатор, содержащий 10 мл холодного раствора для гомогенизации (10 мМ трис-НС1 pH 7,4; 60 мМ NaCl; 10 мМ ЭДТА; 0,15 мМ спермина; 0,15 мМ спермидина; 0,5% (по объему) Тритона Х100). Мы используем гомогенизатор фирмы Wheaton объемом 15 мл. Гомогенизируйте и профильтруйте гомогенат через плотную марлю в находящуюся на льду стерильную центрифужную пробирку. При необходимости обработайте таким же образом еще 1—2 г ткани. Промойте гомогенизатор 4 мл холодного раствора для гомогенизации и профильтруйте, смыв в ту же пробирку.
4. Как можно быстрее отцентрифугируйте гомогенат при 7000 об/мин и 4°С в охлажденном роторе в течение 7 мин.
5. Слейте надосадок и ресуспендируйте осевшие ядра в 10 мл холодного раствора для гомогенизации. Проще всего для этого слегка размешать осадок в пробирке пестиком гомогенизатора, перелить содержимое пробирки в гомогенизатор и гомогенизировать еще раз.
6. Повторите стадии 4 и 5.
7. Промытые ядра тщательно ресуспендируйте с помощью гомогенизатора в соответствующем объеме холодного раствора для гомогенизации и перенесите в пробирку с крышкой (напри-
60
Глава 1
мер, фирмы Falcon объемом 50 мл). Из концентрированного 10%-ного (вес/объем) раствора добавьте саркозил до 2% и перемешайте, осторожно переворачивая пробирку. В результате быстрого лизиса образуется вязкий раствор. Для достижения полного лизиса проинкубируйте пробирку 1 ч при 50 °С.
8. Взвесьте лизат. Добавьте на 1 г лизата 1,25 г CsCl (55,55% по весу). Растворите CsCl, осторожно переворачивая пробирку.
9. Наполните этим раствором центрифужные пробирки и
центрифугируйте до достижения равновесия при комнатной температуре (48 ч при 39 000 об/мин в роторе Beckman SW 41; 24 ч при 55 000 об/мин в роторе Beckman Туре 65; 16 ч при
45 000 об/мин в роторе Beckman VTi 50).
10. Проткните стенку пробирки чуть выше дна (на дне — осадок РНК) толстой иглой для инъекций и соберите фракции по каплям. Содержащие ДНК фракции (0,5—1 мл), находящиеся вблизи центра пробирки, легко отличить по их высокой вязкости. Если ДНК слишком разбавлена и обнаружить ее по-вязкости трудно, нанесите по 2—5 мкл из каждой фракции на поверхность 1%-ного агарозного геля, содержащего 1 мкг/мл бромида этидия. После того как капли подсохнут и ДНК диффундирует в агарозу, содержащие ее фракции можно обнаружить по их флуоресценции при облучении УФ-светом.
11. Эта стадия необязательна, однако позволяет получить более чистый и концентрированный раствор ДНК. Соберите содержащие ДНК фракции, разбавьте раствором CsCl (55,55 вес. %) и центрифугируйте снова в пробирке меньшего объема (например, для роторов Beckman SW 50.1 или Beckman VTi 65). Фракции соберите так же, как описано выше.
12. Соберите содержащие ДНК фракции и обработайте одним из следующих способов:
а) Проведите исчерпывающий диализ против ТЕ при 4°С. На этой стадии концентрация препарата может быть уже-достаточно высокой. Концентрированные препараты храните-в стерильных пробирках при 4°С. Если концентрация ДНК мала, сконцентрируйте ее, несколько раз осторожно экстрагируя равным объемом изо- или 2-бутанола [2]. Для удаления следов бутанола отдиализуйте концентрированный раствор против ТЕ при 4°С. Этот метод, вероятно, наиболее эффективен.
б) Разбавьте раствор втрое ТЕ, добавьте два объема этанола и очень осторожно смешайте, переворачивая пробирку. Нити осажденной ДНК слипаются и всплывают на поверхность раствора в виде комка. Зацепите этот комок концом пластиковой пипетки и перенесите в находящуюся на льду пробирку. Избыток жидкости удалите микропипеткой и растворите ДНК в нужном объеме ТЕ. Чистая ДНК, если она не
Использование А,-векторов для конструирования библиотек ДНК
