Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2. Пронумеруйте нитроцеллюлозные фильтры карандашом, наложите их на чашки и дайте полностью пропитаться влагой. Нитроцеллюлоза может быть электростатически заряжена и притягиваться к поверхности агара. Чтобы фильтр неожиданно не прилип к чашке в неправильном положении, придерживайте его руками (в перчатках). При наложении на чашку слегка согните фильтр так, чтобы сгиб коснулся середины чашки. Осторожно опускайте края фильтра, выжимая из под него воздух и не допуская образования морщин и пузырей под фильтром. При работе с очень большими фильтрами полезно разгладить фильтр рукой (в перчатке). Если вы предполагаете, что между снятием реплики и отбором положительно гибридизующихся бляшек пройдет больше двух недель, используйте стерильные (автоклавированные) фильтры.
3. На край чашки и фильтра нанесите три асимметричные отметки, протыкая одновременно фильтр и агар до дна чашки иглой для подкожных инъекций. Второй фильтр (дубликат) можно маркировать в тех же точках, рассматривая на просвет. Отметки в агаре будут видны сквозь фильтр-дубликат.
4. После того как фильтр пропитается (~30 с для первого фильтра и 1 мин для дубликата), осторожно, начиная с края, снимите фильтр с агара пинцетом с тупыми концами. Более длительная выдержка результатов не ухудшает. Если верхний агар прилип к фильтру и поднимается вместе с ним, опустите фильтр на место и начните с другой точки.
5. Положите фильтры обращенной к агару стороной вверх на лист фильтровальной бумаги Whatman (ЗММ или другой), пропитанный денатурирующим раствором (0,5 М NaOH; 1,5 М NaCl). Через 5 мин перенесите фильтры на другой лист Whatman пропитанный на этот раз нейтрализующим раствором
68
Глава 1
(0,5 М трис-НС1 pH 8,0; 1,5 М NaCl). Через 5 мин снимите их и погрузите на 5 мин в нейтрализующий раствор. Промойте фильтры раствором 2XSSC, положите на бумагу ЗММ и дайте просохнуть. Поместите фильтры между листами бумаги ЗММ и запеките при 80 °С в течение 2 ч, желательно в вакууме.
При обработке большого количества фильтров бывает трудно выдержать указанные выше интервалы. Критична лишь стадия денатурации. Если фильтры слишком долго находились в растворе NaOH, они становятся весьма ломкими. То же происходит при слишком длительном запекании.
6. Прогибридизуйте фильтры с имеющимся зондом и отмойте в выбранных условиях (см. работу [2]). Удалите избыток жидкости с фильтров, поместив их на лист бумаги Whatman ЗММ. Если может понадобиться повторная промывка фильтров, их не следует пересушивать.
7. Поместите влажные фильтры между слоями тонкой поливинилхлоридной пленки (типа Saran Wrap). Благодаря этому фильтры не будут смещаться при радиоавтографии и их не нужно специально закреплять. Кроме того, если фон будет слишком велик, фильтры можно легко снять для дополнительной отмывки. Наложите на фильтры рентгеновскую пленку для радиоавтографии [2, 28]. Для ориентации пленки относительно фильтров между слоями поливинилхлоридной пленки поместите небольшие клейкие ярлычки, подписанные радиоактивными чернилами.
8. Отметьте на рентгеновской пленке положение асимметричных меток. Совместите автографы фильтров-дубликатов и отметьте положения пятен, подходящих по размеру к бляшкам и совпадающих по положению на обеих репликах. С исходной чашки отберите либо соответствующую бляшку, либо столбик агара из нужной области (используйте широкий конец стерильной пастеровской пипетки). Поместите бляшку или столбик в 1 мл фагового буфера, добавьте 1 каплю хлороформа и проинкубируйте для диффузии фага 1 ч при комнатной температуре или ночь при 4°С. При использовании чашек Петри диаметром 90 мм совместить фильтр с чашкой довольно легко. При использовании чашек большего размера фильтр может быть несколько растянут или деформирован при обработках. Поэтому во избежание ошибок размер отбираемого столбика агара должен в этих случаях быть достаточно большим. Для фильтров большого размера число ориентационных меток желательно увеличить.
9. С одной чашки можно последовательно снять более пяти реплик. Если фильтры перестают увлажняться, чашки следует выдержать несколько дней при 4°С для появления в них влаги. Помехи за счет неспецифической гибридизации обычно выражены сильнее для первой реплики.
Использование А-векторов для конструирования библиотек ДНК
69
10. Если чашки предполагается хранить длительное время либо если они содержат массив, предназначенный для пересева с помощью трафарета (разд. 12), необходимо предотвратить размножение на этих чашках устойчивых к фагу К Е. coli и других бактерий. Этого можно отчасти достигнуть, обработав поверхность агара парами хлороформа. Положите на стол лист алюминиевой фольги. Кусок бумаги Whatman ЗММ, совпадающий по форме с чашкой, но несколько меньший по размеру,, положите на фольгу и пропитайте хлороформом. Наложите на него перевернутую чашку и проинкубируйте 10—15 мин. Хлороформ не должен попадать на пластиковые чашки, так как пластик легко в нем растворяется, после чего крышка может приклеиться к чашке. Иногда на поверхности агара могут появиться капельки конденсированного хлороформа, которые при переворачивании чашки растекаются. Это, по-видимому, не приводит к сколько-нибудь заметному размыванию бляшек. Полезно также добавить к агару противогрибковые препараты, например фунгизон.
