Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
16. Выбор бактерии-хозяина
Обсуждающиеся в этом разделе штаммы Е. coli и их гене^ тические характеристики приведены в табл. 2.
4»
Таблица 2. Бактерии, используемые в качестве хозяев
Использование А-векторов для конструирования библиотек ДНК
53
16.1. Система рестрикции — модификации хозяина
Все бактериальные штаммы, которые можно использовать в качестве хозяина для фага К, представляют собой варианты Е. coli К12. Эти бактерии в норме содержат рестриктазу (ЕсоК.), расщепляющую ДНК в сайтах, узнаваемых этим ферментом. Чтобы защитить собственную ДНК, Е. coli К12 продуцирует метилазу, которая модифицирует сайты узнавания и тем самым предохраняет их от расщепления. Немодифицированная ДНК фага, однако, будет рестрицироваться также, как и ДНК-встав-ки рекомбинантных молекул (последние будут подвергаться действию рестриктазы даже в том случае, если вектор был подучен в модифицирующем штамме). Этого можно избежать, если в качестве хозяина для размножения рекомбинантных фагов использовать дефектные по рестрикции бактерии (rk_). Штамм hsdR- дефектен по рестрикции, но не по модификации (rk_mk+), а штамм hsdS~ дефектен по обеим функциям (rk~mk_). Фенотип rk~ легко распознать по неспособности таких бактерий различать модифицированные и немодифицированные производные фага X. Немодифицированный фаг образует бляшки на гк~-хозяине примерно на три порядка эффективнее, чем на rk+.
16.2. Система генетической рекомбинации хозяина
Е. coli К12 способна в той или иной степени осуществлять гомологичную рекомбинацию. Известно несколько путей рекомбинации (рис. 9). Те из них, которые зависят от продуктов гесВС+ и recF+, нуждаются также и в продукте гена гесА дикого типа, в то время как путь рекомбинации RecE от него не зависит. Последовательность Chi стимулирует только рекомби-«ацию RecBC+-THna.
Рекомбинационные характеристики штаммов Е. coli следует учитывать как при выборе хозяина для амплификации и скри-«инга библиотек (см. также разд. 8 и 9), так и при получении рекомбинантного фага в высоком титре для выделения ДНК. Было показано, например, что гомологичная рекомбинация между негомологично расположенными повторяющимися последовательностями фага % приводит к появлению дупликаций и делеций, хотя этот процесс и ограничен в некоторой степени размерами получающихся в результате геномов. Особенно трудно размножать без делеций палиндромные последовательности. Хотя не так уже много данных о Rec-зависимой нестабильности рекомбинантных фагов опубликовано, такая нестабильность наблюдается нередко. Кроме того, может существовать Rec-неза-©исимая (и, вероятно, неизбежная) нестабильность. Размножение библиотеки в клетках Rec- уменьшает гомологичную реком-
54
Глава 1
бинацию, однако выход фага при этом падает. Причиной этому может быть как понижение числа фаговых частиц, высвобождающихся при лизисе одной клетки (урожай фага), так и относительно высокое содержание мертвых клеток в Нес_-культуре. Ведь фаговая частица, которая адсорбировалась на мертвой клетке, не размножается. Таким образом, при работе с Rec~-xo-зяином потенциальный выигрыш в стабильности клонированных последовательностей оборачивается уменьшением выхода фага.
Для генетической селекции red~ gam.- (Spi-) -производных векторов EMBL на лизогенном по Р2 хозяине необходимо использовать клетки Rec+. В поддержании лизогении по фагу Р2 участвует продукт гена recBC (разд. 14), а образование конкатенированных ДНК фага невозможно без продуктов генов гесА, гесВ и гесС (разд. 13.1).
Рекомбинанты red~ gam+, образующиеся из векторов Харон 34 и Харон 35, можно размножать в самых жестких Rec^-условиях (гесА~). Если отказаться от генетической селекции, то рекомбинанты с генотипом red^ gam~ также можно размножать в Rec_-хозяине (в этом случае центральный фрагмент необходимо либо удалить, либо каким-то способом исключить возможность его лигирования с плечами вектора). Например, можно в качестве хозяина использовать штамм, несущий плазмиду, в состав которой входит ген gam фага К (Г. Кроуз, личное сообщение). Эта плазмида сконструирована так, что ген gam начинает экспрессироваться при заражении клетки фагом. В данном случае можно использовать хозяина гесА~ гесВС+, так как его нуклеа-за RecBC инактивирована и репликация будет протекать нормально (разд. 13.1). Такой способ, однако, неприменим в тех случаях, когда необходим скрининг библиотеки плазмидными зондами, содержащими участки, гомологичные несущей ген gam плазмиде. В качестве хозяина можно использовать и recBC~~ или гесА~ гесВС~-бактерии без несущей ген gatn плазмиды. Оба этих штамма, однако, растут довольно плохо (особенно второй) и не обеспечивают высокий титр фага. Кроме того, для них характерна высокая частота реверсий и псевдореверсий к Rec+. Таким образом, при получении свежих колоний этого штамма (разд. 18.2) необходимо проверить их генотип. Если допустимы условия Rec+, а селекция по Spi необязательна, можно использовать хозяев recBC~ sbcA~ (путь рекомбинации RecE) или recBC~sbcB- (путь RecF). Оба этих штамма хорошо растут и допускают репликацию по типу «катящегося кольца», в них могут размножаться и gam+-, и gam.--фаги, однако больший урожай дают фаговые частицы gam~. Если необходимо позаботиться о сохранении палиндромных последовательностей, стоит испытать в качестве хозяина штамм recBC~ sbcB~ [22] (см. также работу Ваймана, Вольфа и Ботштейна, в печати). Из всего вышесказанного следует, что в целях максимальной безопасно-
