Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
11. Для перенесения бляшек с чашки на чашку, а также для репликации библиотеки при помощи трафарета залейте слой верхней агарозы, содержащий 10 мМ MgCh и 0,1 мл клеток на чашку диаметром 90 мм. Остудите агарозу в течение нескольких минут при комнатной температуре или при 4вС. Достаточное количество фаговых частиц будет перенесено при легком касании поверхности чашки зубочисткой или трафаретом. Переверните чашку и проинкубируйте ночь при 37 °С.
12. Перед тем как использовать ДНК-зонд для следующего скрининга, его необходимо заново денатурировать. Если гибридизацию проводят в 50%-ном формамиде, прогрейте зонд 10 мин при 80 °С. В остальных случаях прокипятите зонд в течение 5 мин. Перед использованием охладите во льду.
Благодарности
Мы благодарим наших коллег из Эдинбурга, Глазго, Лондона и Гейдельберга за советы по различным аспектам экспериментальных методик. Благодарим также Джона Люнека, Эндрью Мак-Кейба, Кея Мюррея, Шона Скэхилла и Барбару Скин за замечания по различным разделам рукописи в ходе неоднократных ее доработок. Хотим отметить терпение, проявленное Линдой Кер, Мэй Вилд и Бетти Мак-Крэди при подготовке рукописи.
Литература
1. Hendrix R. W„ Roberts J. W., Stahl F„ Weisberg R. A. (eds.). Lambda II,
published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1983.
2. Maniatis Т.. Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular Cloning. A Laboratory
70
Глава 1
Manual, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. [Имеется русский перевод: Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984.]
3. Sanger F., Coulson A, P., Hong G.-F., Hill D. F., Petersen G. B. J. Mol. Biol., 162, 301 (1982).
4. Williams B. G., Blattner F. R. In: Genetic Engineering, Setlow J. K. and Hollaender A. (eds.), Plenum Press, New York, Vol. 2, p. 201 (1980).
5. Brammar W. J. In: Genetic Engineering, Williamson R. (ed.), Academic Press, London, Vol. 3, p. 53 (1982).
6. Frischhauf A.-M., Lehrach H., Poustka A., Murray N. J. Mol. Biol., 170, 827 (1983).
7. Karn J., Brenner S., Barnett L. In: Methods in Enzymology, Wu R., Grossman L. and Moldave K. (eds.), Academic Press, New York and London, Vol. 101, p. 3 (1983).
8. Loenen W. A. М., Blattner F. R. Gene, 26, 171 (1983).
9. Maniatis Т., Hardison R. C., Lacy E., Lauer J., O’Connell C„ Quon D., Sim D. K., Efstratiadis A. Cell, 15, 687 (1978).
10. Fuchs R., Blakesley R. In: Methods in Enzymology, Wu R., Grossman L. and Moldave K. (eds.), Academic Press, New York and London, Vol. 3, p. 3
(1983).
11. Enquist L., Sternberg N. In: Methods in Enzymology, Wu R. (ed.), Academic Press, New York and London, Vol. 68, p. 281 (1979).
12. Clarke L., Carbon J. Cell, 9, 91 (1976).
13. Sealey P. G„ Southern E. In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids — A Practical Approach, Rickwood D., Hames B. D. (eds.), IRL Press, Oxford, p. 39, 1982.
14. Benton W. D., Davis R. W. Science, 196, 180 (1977).
15. Davis R. W., Botstein D., Roth I. R. Advanced Bacterial Genetics, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1980.
16. Schteif R. F„ Wensink P. C. Practical Methods in Molecular Biology, published by Springer-Verlag Inc., New York, 1981.
17. Rodrigues R. L., Tait R. C. Recombinant DNA Techniques, an Introduction, published by Addison-Wesley, Reading, Massachusetts, 1983.
18 Rackwitz H.-R., Zehetner G., Frischauf A.-M., Lehrach H. Gene, 30, 195
(1984).
19 Hadfield С In: Focus, Betesda Research Laboratories Inc., Gaithersburg, Maryland, 20877, Vol. 5, No. 4, 1983.
20 Bender W. Spierer P., Hogness D. S. J. Mol. Biol., 168, 17 (1983).
2L Horii Z., Clark A. J. J. Mol. Biol., 80, 327 (1973).
22 Leach D. R. F., Stahl F. W. Nature, 305, 448 (1983).
23. Hohn B. In: Methods in Enzymology, Wu R. (ed.), Academic Press, New
York and London, Vol. 68, p. 299 (1979). ,. . . . ~
24. Collins J. In: Methods in Enzymology, Wu R. (ed.), Academic Press, New
York and London, Vol. 68, p. 309 (1979) .
25 Poustka A Rackwitz H.-R., Frischauf A.-M., Lehrach H. Proc. Natl. Acad. Sci.
' USA, 82, 4129 (1984).
26. Shapiro D. J. Anal. Biochem., 110, 229 (1981).
27 Bingham P. М., Levis R., Rubin G. M. Cell, 25, 693 (1981) .
28. Laskey R. A. In: Methods in Enzymology, Grossman L. and Moldave K. (eds.), Academic Press, New York and London, Vol. 65, p 363 (1980)
29 Karn J., Brenner S., Barnett L„ Cesareni G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5172 (1980).
ГЛАВА 2
КОНСТРУИРОВАНИЕ И СКРИНИНГ БИБЛИОТЕК кДНК В ВЕКТОРАХ gtIO И / g'tll
Тхань В. Кхунь, Ричард А. Янг, Рональд В. Дэвис
1. Введение — Х-векторы для клонирования кДНК
Изучение структуры и экспрессии генов эукариот включает в качестве обязательного промежуточного этапа клонирование этих генов. Во многих случаях клоны эукариотических генов получают, используя ДНК-копии матричной РНК, кодируемой этими генами (клоны кДНК). Стратегия такого подхода состоит в следующем: из соответствующей ткани или линии клеток экстрагируют полиаденилированную РНК и на ее основе конструируют библиотеку кДНК, представляющую данную популяцию мРНК. Нужный клон кДНК идентифицируют путем скрининга библиотеки зондами на основе синтетических олигонуклеотидов, кДНК (синтезированных на дифференциально экспрессирующихся мРНК), либо зондами на основе антител. Частота, с которой клоны кДНК, представляющие данную мРНК, встречаются в библиотеке, обычно пропорциональна содержанию этой мРНК в клетке. Для выделения кДНК-кло-нов редких мРНК необходимы очень большие библиотеки кДНК, представляющие многокомпонентные популяции polyA+-РНК. В этой главе подробно описана несложная процедура получения библиотек кДНК, содержащих 105—107 рекомбинантов. Двухцепочечные кДНК, приготовленные по описанному здесь методу, лигируются с одним из А,-векторов. Использование вместо плазмидных векторов векторов на основе фага позволяет применять для введения чужеродных ДНК в клетки Е. coli такой высокоэффективный и воспроизводимый метод, как метод упаковки Я-ДНК in vitro. Высокая эффективность клонирования кДНК в ^-векторах необходима при поиске клонов кДНК, соответствующих редким мРНК, а также в тех случаях, когда исходная мРНК доступна в ограниченных количествах.
