Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
пересушена, растворяется быстро. Проведите исчерпывающий диализ против ТЕ при 4 °С.
13. Приготовленная таким методом ДНК пригодна для конструирования библиотек в ^-векторах и расщепляется большинством рестриктаз. Обработку протеиназой К и(или) экстракцию фенолом можно при необходимости провести между стадиями 7 и 8 или после стадии 12. Экстракцию фенолом следует проводить осторожно. ДНК повреждается меньше всего, еслк наполовину заполненную пробирку медленно перекатывать по-столу.
14. Определите концентрацию ДНК.
15. Проведите электрофорез в 0,3%-ной агарозе с необходимыми стандартами длины (например, интактная ДНК фа* га Я~50 т.п.н., интактная ДНК фага Т4—156 т.п.н.). Высокомолекулярная ДНК мигрирует сравнительно узкой полосой медленнее Я-ДНК.
18.5. Частичное расщепление Sau3A
1. 10 мкг геномной ДНК смешайте с 10 мкл 10х буфера для Sau3A. Объем доведите до 100 мкл стерильной дистиллированной водой.
2. Отберите 20 мкл в микроцентрифужную пробирку (пробирка 1) и по 10 мкл в остальные пробирки (2—9). Охладите во льду.
3. Коммерческие препараты Sau3A (и Mbol) обычно содержат 5—10 ед. активности в 1 мкл. Непосредственно перед использованием разведите фермент рекомендуемым изготовителем раствором до концентрации около 1 ед./мкл. Добавьте 1 мкл в первую пробирку (0,5 ед./мкг/ДНК) и перемешайте. Отберите 10 мкл и смешайте с содержимым пробирки 2 (0,25 ед./мкг). Продолжайте разведение до пробирки 8, тщательно перемешивая. Пробирку 9 оставьте для контроля интактной ДНК.
4. Поставьте пробирки на водяную баню (37 °С) на 1 ч.
5. Остановите реакцию, добавив ЭДТА до 20 мМ. Охладите
пробирки во льду и проанализируйте ДНК горизонтальным электрофорезом в 0,3%-ном агарозном геле при 2 В/см в течение ночи (рис. 2). Низкое напряжение улучшает разрешение высокомолекулярных фрагментов ДНК [13]. 0,3%-ный гель
заливайте в холодной комнате. Перед удалением гребенки наслоите на гель буфер для электрофореза. Гель очень непрочен, обращайтесь с ним осторожно. В качестве стандартов длин подходят ДНК фага К, расщепленная ?coRI или Hindlll либо-один из векторов замещения, расщепленный ВатШ. Окрасьте-гель этидиумбромидом (0,5 мкг/мл в течение 30 мин), промойте 30 мин и сфотографируйте, стараясь не переэкспонировать пленку.
<62
Глава 1
6. Закройте фотографию выше и ниже нужного диапазона размеров (18—22 т. п. н.) и определите концентрацию фермента, дающую максимальную флуоресценцию в этой области. Концентрация фермента, равная половине определенной таким образом концентрации, дает максимальное число молекул в нужной области [2].
7. Проведите препаративную реакцию со 150—300 мкг ДНК. Все переменные (концентрацию ДНК и фермента, время, температуру) установите те же, что и в пробной реакции. Перед добавлением фермента прогрейте раствор ДНК при 37°С, так как для нагрева большого объема требуется некоторое время. Перемешивать реакционную смесь нужно мягко (без механического встряхивателя), но тщательно, чтобы избежать локальных флуктуаций концентрации ДНК и фермента. Реакционную смесь лучше разделить и обработать ферментом при условиях, отличающихся от оптимальных вдвое в большую и меньшую стороны. В противном случае фрагменты с аномальным распределением участков расщепления могут оказаться плохо представленными в библиотеке. Остановите реакцию добавлением ЭДТА до 20 мМ.
8. Проанализируйте аликвоту (аликвоты) ДНК электрофорезом в 0,3%-ном агарозном геле вместе со стандартами длины и проверьте правильность полученного распределения по размерам. Остальную ДНК храните при 4°С.
9. Препараты объедините, осторожно экстрагируйте дважды смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:24:1), добавьте NaCl до 0,3 М и два объема этанола. Смешайте, проинкубируйте 10 мин во льду и соберите ДНК центрифугированием. Промойте осадок дважды 70%-ным этанолом и растворите в 200—500 мкл ТЕ. Растворение ДНК ускорится, если смесь прогреть 10 мин при 65 °С.
18.6. Фракционирование по размеру с помощью градиентного центрифугирования
Фракционирование в градиенте сахарозы описано в работе [2]. Преимущество фракционирования в градиенте хлористого натрия в том, что при этом нет необходимости удалять сахарозу.
1. Приготовьте градиент 5—25% (вес/объем) NaCl в пробирке объемом 12,5 мл (например, от ротора Beckman SW 41). Растворы NaCl должны содержать 3 мМ ЭДТА, pH 8,0. Градиент заливайте медленно (~1 мл/мин), с использованием стандартного прибора.
2. На поверхность градиента наслоите ДНК в объеме 200 мкл. На одну пробирку наносите не более 150 мкг ДНК, так как большие количества ухудшают разрешение.
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
3. Центрифугируйте при 37 ООО об/мин в роторе Beckman SW41 или эквивалентном при комнатной температуре в течение 4,5 ч.
4. Соберите фракции по 0,25 мл в стерильные пробирки типа Эппендорф.
5. Отберите из каждой второй пробирки аликвоты по 25 мкл, разбавьте 3—4 объемами ТЕ и проанализируйте электрофорезом в 0,3%-ном агарозном геле с подходящими стандартами длины (рис. 3). Остаток храните при —20 °С.
