Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
6. К фракциям, содержащим ДНК нужного размера, добавьте равный объем дистиллированной воды и 1 мл этанола. Хорошо смешайте и охладите в течение 10 мин в смеси сухого льда с этанолом либо в течение ночи при —20 °С. Соберите осадок ДНК в микроцентрифуге в течение 15 мин. Удалите надосадок, осадок промойте дважды 70%-ным этанолом и высушите в вакуум-эксикаторе. Растворите каждый из осадков в 20—50 мкл стерильного ТЕ.
7. Объедините нужные фракции и повторите стадии 1—6. Эта стадия необязательна.
8. Нанесите капли по 1—2 мкл из каждой фракции на поверхность 1%-ного агарозного геля, содержащего 1 мкг/мл этидиумбромида. Нанесите рядом серию разведений векторной (или другой) ДНК с известной концентрацией, перекрывающей ожидаемую концентрацию ДНК во фракциях. Дайте ДНК высохнуть и продиффундировать в агарозу. Оцените концентрацию ДНК во фракциях, сравнивая на глаз ее флуоресценцию с флуоресценцией стандартной векторной ДНК.
9. Обработайте концы фрагментов фосфатазой (разд. 3.2 a работа [6]). Эта стадия необязательна.
18.7. Проверка векторной ДНК
1. Распределение сайтов расщепления рестриктазами в векторной ДНК должно соответствовать ожидаемому.
2. Нерасщепленная векторная ДНК должна с высокой эффективностью упаковываться при помощи проверенных упаковочных экстрактов.
3. Полное расщепление векторной ДНК соответствующей рестриктазой (обычно 2—3-кратным избытком BamHl) должно приводить к резкому падению эффективности упаковки (>104 раз). (Партии фермента могут различаться.)
4. При лигировании расщепленного вектора «на себя» выход фага должен восстанавливаться, однако эффективность упаковки всегда будет ниже, чем для нерасщепленного вектора. Причиной малоэффективного лигирования может быть дефектная партия лигазы или лигазного буфера. С другой стороны, липкие концы, образующиеся при обработке рестриктазами,,
64
Глава 1
либо липкие концы самого фага могут быть повреждены. На-лример, некоторые партии рестриктаз или лигаз (чаще всего рестриктаз) могут содержать примесные нуклеазные активности.
5. Некоторые векторы (например, серии EMBL) допускают генетическую селекцию против нерекомбинантных фагов (т. е. фагов с исходной последовательностью) в ходе размножения библиотеки (разд. 14 и 15). В этом случае удаление центрального фрагмента из ДНК расщепленного вектора необязательно. При использовании таких векторов перед реакцией лигирования нужно лишь инактивировать рестриктазу. Необходимо, однако, оценить «фон», возникающий при размножении расщепленного и лигированного вектора на хозяине, непермиссивном для родительского фага. Уровень фона всегда выше нуля и может изменяться в зависимости от партии вектора, рестриктазы или упаковочного экстракта. При рассеве библиотеки для скринин-та этот фон необходимо учитывать.
18.8. Расщепление векторной ДНК
1. Определите эмпирически условия полного расщепления ’векторной ДНК рестриктазой Bam HI. Расщепленную ДНК анализируйте электрофорезом в 0,5%-ном агарозном геле.
2. Расщепите 20—50 мкг векторной ДНК 2—3-кратным избытком BamHl и проверьте результаты с помощью электрофореза аликвоты ДНК (0,5 мкг). Помните о необходимости диссоциировать ДНК, плеч фага К, прогревая образец перед электрофорезом 10 мин при 68 °С. Определите долю нерасщеплен-•ных молекул ДНК при помощи упаковки in vitro и при (Необходимости обработайте ДНК рестриктазой повторно. Хра-!ните препарат вектора при —20 °С.
3. Проведите одну из следующих процедур:
а) Для векторов типа EMBL при использовании генетической селекции против нерекомбинантных молекул вектора инактивируйте рестриктазу (стадия 4) и переходите к клонированию.
б) Инактивируйте центральный фрагмент EMBL с помощью рестриктазы [6]. Для этого добавьте в буфер необходимые для EcoRI компоненты и обработайте вектор трехкратным избытком EcoRI. Инактивируйте фермент (стадия 4), но осаждение для удаления линкерных фрагментов проведите изопропанолом вместо этанола (стадия 5). Переходите к клонированию.
в) Удалите центральный фрагмент. Перед этим инактивируйте фермент (стадия 4), добавьте к препарату векторной ДНК MgCl2 до 10 мМ и проинкубируйте 1 ч при 42 °С для .отжига липких концов фага [2]. Проверьте полноту отжига
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
65
электрофорезом в агарозном геле. В качестве стандартов длины используйте интактную ДНК фага % и аликвоту расщепленной векторной ДНК, прогретой для диссоциации липких концов 10 мин при 68 °С. Отделите плечи фага от центрального фрагмента центрифугированием в градиенте сахарозы, NaCl или KI [2]. Проверьте чистоту ДНК плеч при помощи электрофореза в 0,5%-ном агарозном геле.
4. Инактивируйте рестриктазы осторожной экстракцией равным объемом фенола : хлороформа : изоамилового спирта (25:24:1), а затем хлороформа : изоамилового спирта (24:1). Добавьте NaCl до 0,3 М и осадите ДНК двумя объемами этанола. Соберите осадок в микроцентрифуге, промойте дважды 70%-ным этанолом, подсушите в вакуум-эксикаторе и растворите в подходящем объеме ТЕ в концентрации примерно 200— 500 мкг/мл.
