Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Использование А,-векторов для конструирования библиотек ДНК
57
товленными и не использоваться ни для чего, кроме конструирования библиотек. Необходимо очень тщательно поддерживать их чистоту. Много времени было потеряно в нескольких лабораториях на клонирование последовательностей плазмидной ДНК, случайно попавшей в препараты ферментов или другие реагенты. Следует отметить, что некоторые партии фенола содержат загрязнения или продукты окисления, способные вносить в ДНК одноцепочечные разрывы. Советы по приготовлению и использованию фенола можно найти в работах [1, 16].
2. Проверьте, соответствуют ли физические и биологические свойства векторов ожидаемым. Физическая структура вектора должна быть проверена при помощи рестриктного анализа, а биологические свойства — путем рассева на подходящих индикаторных штаммах. Рост векторов EMBL, например, должен сильно тормозиться на Е. coli, лизогенных по Р2. Необходимо также проверить генотип бактериальных штаммов (гес+/гес~, Р2+/Р2", rk+/rk_, mk+/mk“, см. разд. 16). Способность к рекомбинации можно оценить, облучая бактерии ультрафиолетом [2]. Клетки Rec~ чувствительны к облучению, так как у них нарушена репарация УФ-индуцированных повреждений ДНК.
3. Для осаждения небольших количеств ДНК, хранения и
добавления растворов ДНК, ферментов и т. п. используйте только стерильную пластиковую посуду и наконечники одноразового пользования. Малые количества ДНК могут необратимо сорбироваться на стекле. <
4. При осаждении спиртом небольших количеств ДНК пересушенный осадок плохо заметен (поскольку его очень мало) и легко может быть потерян [26]. Потерять ДНК можно и в вакуум-эксикаторе, если резко сбросить вакуум. Поэтому перед сушкой пробирку следует закрыть парафилмом и проделать в нем несколько отверстий иглой. Для растворения высокомолекулярной ДНК требуется время.
5. При добавлении очень малых объемов следует учитывать погрешность микропипетки. В диапазоне 1—5 мкл ошибка добавления может быть значительной и изменяться от пипетки к пипетке. Поэтому для разбавления малых объемов фермента и других подобных операций следует пользоваться одной и той же микропипеткой. Это особенно важно при определении активности и проведении препаративного расщепления Sau3A и Mbol (см. разд. 3.2). Для объема 1 мкл наиболее воспроизводимые результаты дает, видимо, использование стеклянных микрокапилляров. Будьте очень внимательны при отборе вязких растворов ДНК, так как для того, чтобы раствор заполнил наконечник микропипетки, требуется некоторое время. Для работы с такими растворами полезно отрезать кончик одноразового наконечника,
6. Стерильные растворы ДНК, не содержащие активных ферментов, можно хранить при 4°С длительное время. Замо-
58
Глава 1
раживать растворы более предпочтительно при — 70 °С, а не при —20 °С [15]. Высокомолекулярную геномную ДНК замораживать нельзя.
7. На любой из многих следующих друг за другом стадий клонирования возможны ошибки, иногда по самым простым причинам. Если ошибку удалось заметить вовремя (для чего и ставятся контрольные эксперименты), то опыт еще можно «спасти» в том случае, когда имеется путь к отступлению. Для этого* хорошо иметь запас исходного материала, а на промежуточных, стадиях сохранять часть продуктов реакции. Значение контрольных экспериментов невозможно переоценить!
8. Исчерпывающий список реагентов, сред и буферов можно найти в [1]. Все среды перед использованием необходимо ав-токлавировать.
18.3. Проверка ферментов
Все ферменты необходимо проверить на присутствие нужной активности и отсутствие примесных нуклеазных активностей, которые могут помешать лигированию фрагментов ДНК. Большинство рестриктаз, узнающих гексануклеотидные последовательности, лучше всего проверять, полностью расщепляя небольшую молекулу плазмидной ДНК, имеющую один сайт для этого фермента (pBR322 имеет по одному сайту для ?coRI, BamHI, SalI и tfmdlll). Затем фермент инактивируют, ДНК осаждают этанолом, осадок промывают 70%-ньш этанолом и растворяют в лигазном буфере (разд. 18.1) при концентрации —100 мкг/мл. Половину препарата обрабатывают лигазой. Клетки Е. colt трансформируют на устойчивость к ампициллину препаратами 1) нерестрицированной, 2) рестрицированной, 3) рестрициро-ванной, а затем лигированной плазмиды (гл. 6). Фермент можно использовать для клонирования только тогда, когда высокая* эффективность трансформации восстанавливается после обработки лигазой. Для большинства ферментов, узнающих тетра-нуклеотидные последовательности, трудно подобрать плазмиду с одним сайтом рестрикции, однако ДНК 0X174 содержит лишь-один такой сайт для Sau3A и Mbol.
Эффективность лигирования можно проверить также, если на соседние дорожки агарозного геля нанести рестрицирован-ную пробу и пробу, обработанную рестриктазой и лигазой. При успешном лигировании подвижность ДНК изменится (появятся кольцевая и мультимерные линейные формы).
Препараты фосфатазы значительно различаются по качеству. Фотфатазную активность можно проконтролировать, расщепив рестриктазой небольшую плазмиду и обработав ее фосфатазой, а затем лигазой. Чтобы узнать, не ингибирует ли фосфатаза реакцию лигирования, можно пролигировать не обработанный
