Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
1. Для очистки фага рассейте его на свежей LB-чашке (pH 7,5), как описано в работе Дэвиса и соавт. [11], используя в качестве хозяина штамм BNN93.
Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и Xgtll
81
2. С помощью стеклянных капилляров на 100 мкл отберите несколько индивидуальных мутных бляшек (вместе со столбиком агара) и получите из них индивидуальные фаголизаты на свежих чашках с LB-агаром (pH 7,5).
3. Оттитруйте каждый фаголизат и отберите тот, который содержит наименьшее число примесных мутантных фагов, образующих прозрачные бляшки.
4. Используйте выбранный фаголизат в качестве исходного препарата при получении фага в высоком титре. Для этого приготовьте десять чашек диаметром 150 мм, как описано в работе [И], но со средой LB (pH 7,5), к которой после автокла-вирования добавлена глюкоза (до 0,2%). Добавление глюкозы увеличивает титр препарата Xgt 10 в 10 раз. Для каждой чашки Петри диаметром 150 мм возьмите 2,5-10® фаговых частиц, 125—250 мкл клеток BNN93 и 5 мл мягкого LB-агара (pH 7,5). После 5—6 ч инкубации при 37°С на чашках образуется крап* чатый газон. Чашки никогда не становятся совершенно прозрачными. Если выращивание продолжать, газон станет более мутным и титр фага уменьшится.
5. В момент наибольшего просветления газона перенесите чашки на 4°С. Когда чашки хорошо остынут, наслоите на них по 10 мл холодного (4°С) буфера для разведения фага % с несколькими каплями хлороформа. (Буфер для разведения фага % содержит 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 10 мМ MgCl2; 0,1 мМ Ыа2ЭДТА.) Для диффузии фага в буфер проинкубируйте чашки в течение ночи при 4 °С.
6. Соберите буфер, стараясь не захватить агар.
7. Осадите обломки бактерий центрифугированием в роторе Beckman JA-20 (или эквивалентном) в течение 15 мин при 10 000 об/мин и 4 °С.
8. Осадите фаг центрифугированием в роторе Beckman SW27 в течение 90 мин при 23 000 об/мин и 4°С (в двух стаканах).
9. Ресуспендируйте осадок фага в каждом стакане в 1 мл буфера для разведения фага.
10. Перенесите суспензию фага в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и осадите крупные частицы в микроцентрифуге в течение 5 с.
11. Надосадок со стадии 10 нанесите на ступенчатый градиент CsCl, как описано Дэвисом и соавт. [11]. Отцентрифу-гируйте первый раз, наслоив суспензию фага на верхнюю часть градиента, а второй раз — в обращенном градиенте, поместив суспензию на дно пробирки. Для очистки фага с 10 штоковых чашек диаметром 150 мм готовьте градиент в двух пробирках ротора Beckman SW50.1. Ступенчатые градиенты готовьте на химически чистом CsCl.
12. Очищенный в CsCl фаг храните при 4°С.
6—196
S2
Глава 2
13. Выделите фаговую ДНК при помощи экстракции фор-мамидом, как описано Дэвисом с соавт. [11].
14. Средний выход ДНК A,gtlO с 10 чашек диаметром 150 мм ¦составляет 0,5—1 мг.
2.4.3. Размножение % gtl 1
Фаг A,gtll получают путем индукции лизогенного по A,gtll штамма BNN97 при температуре 43 °С. При этой температуре >инактивируется температурочувствительный репрессор (с1857).
1. Рассейте BNN97 на отдельные колонии на чашках с агатом LB (pH 7,5) при 32 °С.
2. Для проверки лизогена на чувствительность к 42 °С переколите стерильной зубочисткой несколько индивидуальных колоний в ряд на две одинаковые чашки с LB-средой (pH 7,5). Одну из них инкубируйте при 42 °С, а другую — при 32 °С.
3. Убедившись в чувствительности клеток к температуре 42 °С, перенесите одну колонию в 10 мл LB-бульона (pH 7,5) и проинкубируйте ночь при 32 °С.
4. 10 мл ночной культуры внесите в 1 л LB-бульона (pH 7,5), к которому добавлен MgC^ до 10 мМ (32 °С). Проводите инкубацию с хорошей аэрацией при 32 °С до С)Пбоо=0,6.
5. Быстро перенесите культуру в заранее нагретую до 43— •44 °С водяную баню и проинкубируйте при этой температуре в течение 15 мин с хорошей аэрацией.
6. Понизьте температуру до 37—38°С и продолжайте инкубацию с хорошей аэрацией в течение 3 ч. Не позволяйте культуре охлаждаться ниже 37 °С.
7. Добавьте к культуре 10 мл хлороформа и перемешивайте 10 мин при 37 °С. Суспензия должна стать прозрачной.
8. Удалите обломки бактерий центрифугированием в роторе Beckman JA-10 (или эквивалентном) в течение 10 мин при «6000 об/мин и 4°С.
9. Соберите фаг центрифугированием в роторе Beckman .JA-10 (или эквивалентном) в течение 8 ч при 8000 об/мин
и 4 °С.
10. С помощью пастеровской пипетки тщательно ресуспендируйте осадок фага в 4 мл буфера для разведения. (Буфер для разведения фага К содержит 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 10 мМ MgCb; 0,1 мМ ЫагЭДТА.)
11. Добавьте равный объем фагового буфера, насыщенного CsCl (используйте химически чистый CsCl).
12. Для формирования содержащей фаг зоны центрифугируйте в роторе Beckman SW50.I 48 ч при 35000 об/мин и 20 °С.
13. Отберите с помощью шприца содержимое зоны фага. Она должна находиться вблизи центра пробирки. Соберите фаг :в объеме приблизительно 0,5 мл.
