Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 32

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 253 >> Следующая

76
Глава 2
вектор ^gtll предназначен для высокоэффективной экспрессии чужеродной ДНК. В ходе амплификации библиотеки некоторые из рекомбинантов могут продуцировать полипептиды, уже в небольших количествах токсичные для фага или клетки-хозяина. Это приводит к уменьшению относительного содержания таких рекомбинантов в библиотеке. На практике некоторая неравномерность роста рекомбинантов ^gtll сохраняется даже в присутствии /ас-репрессора, подавляющего транскрипцию с промотора гена |}-галактозидазы. Так как при амплификации библиотек, клонированных в ^gtll, наблюдается ускоренный рост части рекомбинантных фагов, мы рекомендуем использовать библиотеки, сконструированные в A-gtll, только для скрининга при помощи антител.
1.4. Методы, описанные в этой главе
Отбирая методы для этой главы, авторы ставили перед собой цель достаточно полно описать конструирование библиотек кДНК и различные методики их скрининга. Разд. 2 содержит подробное изложение относительно простой процедуры синтеза кДНК и клонирования ее в ^gtlO и igtll. В разд. 3 обсуждаются подходы к скринингу ^.-библиотек зондами на основе нуклеиновых кислот. Большая часть этого материала уже рассмотрена в других руководствах [6, 11]. В остальных случаях мы отсылаем читателя к оригинальным публикациям. В разд. 4 представлен метод скрининга при помощи антител библиотек, клонированных в экспрессирующем векторе A,gtll. Наконец, в разд. 5 говорится об очистке составных (включающих р-галак-тозидазу) полипептидов — продуктов экспрессии рекомбинантных клонов в ^gtll.
2. Синтез и клонирование двухцепочечной кДНК в Xgt10 и kgtll
Схема описанного в этой главе метода получения и клонирования кДНК приведена на рис. 3. Обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц катализирует синтез кДНК, используя в качестве матрицы poly(А+)-РНК, а в качестве затравки— oligo(dT) 12-18 [12]. Продукт (кДНК) отделяют от мРНК-матрицы путем тепловой денатурации. ДНК-полимераза I Е. coli, используя в качестве затравки З'-конец первой цепи, синтезирует вторую цепь кДНК [12, 13]. Одноцепочечная шпилька, соединяющая первую и вторую цепи, удаляется с помощью нуклеазы SI [12]. Двухцепочечную кДНК затем обрабатывают метилазой ?coRI в присутствии S-аденозилметиони-яа, для того чтобы предохранить сайты узнавания EcoRl от расщепления соответствующей рестриктазой. После краткой об-
Конструирование библиотек в векторах XgtlO и Xgtll______________77
мРНК 5'-
¦А„3'
Обратная транскриптаза ОлигоСсИ)^-^ оц ДНК 3'(—^----------------Тп5'
ДНК-полимераза I
------ТП5',
------Ап 3
ДЦДНК
Нуклеаза S1
-------Тп
------- А„
Me
Метилаза Eco RI
Me
Me
Eco RI-Линкеры
it
Me,,
Me
Eco RI
m
Me
„Me
фракционирование no размеру(>500п.н^
:\лигирование//
I
Упаковка
Ж
Ж
RI _i______
1ДНК-вектор
Всо RI
Рекомбинантный фаг А
Рис. 3. Схема синтеза двухцепочечной кДНК и клонирования ее в XgtlO и A,gtll. Объяснения см. в тексте.
работки ДНК-полимеразой I, увеличивающей число двухцепочечных молекул кДНК с тупыми концами [14], к этим концам с помощью лигазы присоединяют fcoRI-линкеры. Ненужную часть линкеров удаляют, обрабатывая ДНК рестриктазой ?coRI. Затем реакционную смесь пропускают через колонку с Био-Гелем А50т. Этот этап позволяет решить две задачи:
1) отделить кДНК от избытка линкеров, мешающих лигированию кДНК с векторной ДНК; 2) фракционировать двухцепочечную кДНК по размеру.
Фракции, содержащие двухцепочечную кДНК нужного размера (например, >500 п. н.), собирают, лигируют в небольшом объеме с расщепленным ?coRI вектором igtlO или Xgtll и упаковывают in vitro. Образовавшиеся фаговые частицы рас-
78
Глава 2
севают на подходящем штамме Е. coli и визуально определяют процент рекомбинантов. При использовании A,gtlO рекомбинантные фаги отличаются морфологией бляшек. В случае A,gtll рекомбинантные фаги образуют бесцветные бляшки на supF lacIQ-xозяине в присутствии индуктора lac-оперона IPTG и хромогенного субстрата р-галактозидазы Xgal. После подсчета числа рекомбинантов библиотеку кДНК рассевают для амплификации и приготовления реплик на нитроцеллюлозных фильтрах.
Для успешного клонирования кДНК весьма важны также две не описанные в этой главе методики: выделение полиаде-нилированной РНК из тотального препарата РНК при помощи аффинной хроматографии на oligo(dT)-целлюлозе и приготовление экстрактов для упаковки ^-ДНК in vitro. Эти методики приведены в работе [6]. Кроме того, надежная процедура приготовления экстрактов для упаковки in vitro описана в работе [5].
2.1. Ферменты
1. Обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц — фирмы Seikagaku America, Inc.
2. ДНК-полимераза I Е. coli, выделенная из клеток Е. colt 594 по методу [11], либо фирмы New England Biolabs.
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed