Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Подготовку экстрактов для упаковки in vitro, а также саму" реакцию упаковки проводят согласно методике, описанной в* работе [6] или так, как следует из работы [5].
94
Глава 2
2.5.12. Рассев гибридных фагов hgtIO для скрининга или амплификации
Последующие операции проводят на газоне клеток BNN93 я BNN102, приготовленных так, как указано в разд. 2.4.1.
Определите, какова доля рекомбинантных фаговых частиц (образующих прозрачные бляшки). Для этого рассейте небольшую часть (0,01—0,1%) упакованных фагов на хозяине BNN93. Используйте чашки с обычной агаризованной средой LB (без глюкозы), так как на этой среде легче различить прозрачные и мутные бляшки. Полезно также выделить ДНК из нескольких прозрачных бляшек описанным в работе Дэвиса с соавт. [11] экспресс-методом и с помощью рестриктного анализа убедиться, что они содержат вставочные фрагменты. Небольшие вставки в XgtlO легче всего обнаружить, расщепляя гибридную ДНК Ват HI или Hindlll (вместо ?coRI), так как сайты для этих рестриктаз фланкируют сайт, по которому происходит внедрение чужеродной ДНК.
Для скрининга библиотеки зондами на основе нуклеиновых кислот рассейте упакованную библиотеку на чашках с LB-ara-ром (pH 7,5), используя в качестве хозяина мутант hflA 150. С этих чашек можно получить фильтры-реплики так, как описано в работах [6, 11]. При определении плотности бляшек число бляшкообразующих единиц рассчитайте только по прозрачным бляшкам, так как мутные бляшки образуются на hflA 150-хозяине с низкой эффективностью. A,gtl0 — весьма жизнеспособный фаг, образующий очень крупные бляшки. Если для увеличения плотности бляшек на чашке нужно уменьшить их размер, следует либо увеличить число хозяйских клеток, либо использовать более старые и сухие чашки с LB-агаром.
Так как при амплификации библиотеки плохо растущие рекомбинанты, как правило вытесняются, мы рекомендуем вести скрининг библиотек сразу после упаковки. Если библиотеку все же необходимо амплифицировать перед скринингом, высейте ¦фаг на свежие 150 мм чашки с LB-агаром (pH 7,5) (105 прозрачных бляшек на чашку), используя в качестве газона клет-жи BNN102 (125 мкл на чашку). Приготовьте фаголизаты так, как описано Дэвисом и соавт. [11]. Титр фага в таком препарате составляет обычно от 5-1010 до 10й б.о.е./мл. Храните препараты с хлороформом при 4°С. Для длительного хранения внесите диметилсульфоксид до 7% и поместите в глубокий холод (—70 °С). При таком способе хранения титр фага снижается за несколько лет не более чем в 2—3 раза.
2.5.13. Рассев гибридных фагов A.gt11 для амплификации
Дефектный по протеазе /ои-мутант Y1090, использующийся для рассева библиотек фага ^gtll, имеет функционально активную систему рестрикции-модификации. В связи с этим полу-
Конструирование библиотек в векторах A.gtlO и Xgtl 1
ченную в A,gtll библиотеку нельзя рассевать на Y1090 сразу после упаковки, а следует сначала амплифицировать на hsdR~ hsdM+-клетках Y1088.
Клетки Y1088 приготовьте согласно указаниям разд. 2.4.1, Чтобы при амплификации избежать вытеснения плохо растущих фагов, необходимо подавить синтез токсичных для хозяи-на полипептидов (синтезирующихся в виде составных белковг содержащих фрагмент р-галактозидазы), кодируемых рекомбинантными фагами. Поэтому для амплификации используют клетки Y1088, продуцирующие lac-репрессор.
Для определения доли рекомбинантов и проверки представительности библиотеки высейте небольшое число упакованных in vitro фаговых частиц (— 100) при 42 °С на газон Е. colt Y1088, используя для этого чашку Петри диаметром 90 мм, В 2,5 мл мягкого агара на LB (pH 7,5) внесите 40 мкл раствора Xgal (40 мг/мл) и 40 мкл 1 М IPTG. На этой среде родительский фаг образует синие бляшки, а рекомбинанты — бесцветные (некоторые рекомбинантные бляшки иногда имеют слегка синеватую окраску). Полезно также выделить ДНК из нескольких бесцветных бляшек по методу Дэвиса с соавт. [11J и при помощи рестриктного анализа убедиться, что фаговые частицы, образующие эти бляшки, содержат фрагменты-вставки.
Для амплификации высейте библиотеку на свежие 150 мм чашки с LB-агаром (pH 7,5) (106 б.о.е. на чашку). В качестве газона используйте 600 мкл клеток Y1088. Инкубируйте чашки при 42 °С. Приготовьте фаголизаты по методу Дэвиса и соавт. [11]. Титр фага в таком препарате составляет обычно от 5-1010, до 10й б.о.е./мл. Храните препараты так, как описано в разд. 2.5.12.
Скрининг библиотек в A,gtll можно производить и прямо, без амплификации, если применить описанную ниже методику.
0,1 мл клеток Y1088 смешайте с таким объемом фаговой суспензии, который содержит 105 б.о.е. Адсорбируйте 15 мин при
37 °С. После этого внесите 0,5 мл клеток Y1090, добавьте 7,5 мл мягкого LB-агара и немедленно вылейте на выдержанную двое суток чашку с LB-агаром (pH 7,5). Получение фаговых бляшек для приготовления нитроцеллюлозных фильтров-реплик описано в разд. 4.2 (начиная со стадии 6).
Попытки разработать генетический метод селекции рекомбинантных фагов A,gtll оказались неудачными. Это можно объяснить тем, что подобная селекция основывается на различной способности клеток поддерживать рост рекомбинантных и нерекомбинантных фагов. Некоторые из рекомбинантных фагов экспрессируют токсичные для клеток полипептиды, что делает такой подход малопригодным. Вот почему количество рекомбинантных фаговых частиц должно быть преобладающим уже
