Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и A,gtll
85
Таблица 2. Синтез второй цепи кДНК
1. В пробирку, содержащую 50 мкл продукта реакции синтеза первой цепи (стадия 5 табл. 1), внесите 50 мкл двукратного буфера для синтеза второй цепи’>; 1 мкл 10 мМ d(ACGT)TP; 5 мкл или 90 единиц21 гомогенной ДНК-полимеразы I (концентрация 1 мг/мл). Конечный объем реакции составит 106 мкл.
2. Проинкубируйте смесь 5 ч при 15 °С.
3. Прежде чем перейти к осуществлению следующих стадий (табл. 3), отберите 1 мкл продуктов реакции для электрофореза в геле.
') Буфер для синтеза второй цепи содержит 100 мМ HEPES, доведенный до pH 6,9
КОН; 100 мМ КС1; 20 мМ MgClj.
2) 1 единица ДНК-полимеразы I катализирует включение 10 иМ нуклеотида за
30 мин при 37 °С при использовании polyd (АТ) в качестве матрицы-затравки.
с помощью дополнительной очистки ро1у(А)+РНК. Другая причина независимого от oligo(dT) включения метки может быть связана с качеством препарата обратной транскриптазы. По нашим наблюдениям уровень независимого от oligo(dT) синтеза в коммерческих препаратах обратной транскриптазы намного падает после дополнительной очистки их на колонке с Се-факрилом S200 [18]. Продукт независимого от oligo(dT) синтеза в этом случае гетерогенен по длине в отличие от продукта, образующегося за счет примеси ДНК или рибосомной РНК. Возможно, что в препаратах фермента могут присутствовать небольшие фрагменты ДНК или РНК, способные служить затравкой для синтеза кДНК на экзогенной РНК и удаляющиеся при отделении фермента от малых молекул на колонке. Это служит еще одним (кроме удаления РНКаз) поводом для дополнительной очистки обратной транскриптазы на колонке с Сефакрилом S200.
2.5.2. Синтез второй цепи кДНК
Соответствующая методика приведена в табл. 2.
2.5.3. Обработка нуклеазой SI
Эта процедура описана в табл. 3. Предварительно нужно протитровать нуклеазу SI для определения оптимального количества фермента, необходимого для расщепления шпилечных структур, имеющихся на концах двухцепочечных кДНК. Для этого проинкубируйте двукратные разведения фермента (исходная концентрация около 1200 ед/мл) с радиоактивно меченным продуктом реакции синтеза второй цепи и проанализируйте пробы на щелочном агарозном геле. Выберите концентрацию S1, уменьшающую разброс по размерам двухцепочечной кДНК до значения, получаемого после реакции синтеза первой цепи ,{рис. 4).
86
Глава 2
Таблица 3. Обработка нуклеазой S1
1. В пробирку, содержащую 106 мкл продукта реакции синтеза второй! цепи (стадия 2, табл. 2), добавьте 400 мкл буфера для S11) и приблизительно-600 единиц нуклеазы Sl2>. Конечный объем реакции примерно 506 мкл.
2. Проинкубируйте 30 мин при 37°С.
3. Добавьте 5 мкл 1 М Ыа4ЭДТА, отберите 5 мкл смеси для анализа щелочным гель-электрофорезом3).
4. Экстрагируйте реакционную смесь равным объемом смеси фенол:-СНС13 (1:1), насыщенной ТЕ pH 7,54).
5. Перенесите водную фазу в другую микроцентрифужную пробирку. Экстрагируйте ее трижды равным объемом эфира, насыщенного ТЕ (pH 7,5). Удалите эфир в течение нескольких минут при 37°С.
6. Добавьте 2 объема этанола. Проинкубируйте 1 ч в смеси сухого льда с этанолом, а затем 24 ч при —20 °С.
7. Осадите ДНК в микроцентрифуге (15 мин при 4°С). Осторожно удалите надосадок пастеровской пипеткой. Высушите на воздухе.
') Буфер для S1 содержит 30 мМ ацетата натрия pH 4,4; 250 мМ NaCl; 1 мМ ZnClj.
2) Количество иуклеазы S1 следует определить так, как указано в тексте разд. 2.5.3. Нуклеазу SI, полученную в сухом виде от фирмы Boehringer, растворяют в концентрации Ю00 ед/мл. 1 единица нуклеазы S1 катализирует образование из одиоцепочечной-ДНК 1 мкг кислоторастворимых дезоксирибонуклеотидов за 30 мин при 37 °С.
3) Методика щелочного гель-электрофореза описана в тексте разд. 2.5.3.
*) ТЕ содержит 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 1 мМ Ма3ЭДТА.
После проведения реакции размер ДНК в аликвоте определяют при помощи электрофореза в щелочном геле одновременно с отобранными на предыдущих стадиях (табл. 2 и 3) пробами. Добавьте к этим аликвотам по 1 мкг ДНК-носителя » осадите продукты реакции этанолом для удаления не включившегося 5'-[a-32P]dCTP. Нанесите три образца и стандарты длины в соседние лунки 1,2%-ного агарозного геля, приготовленного на 50 мМ NaCl; 2 мМ ЭДТА. Проведите электрофорез, погрузив гель в 30 мМ NaOH; 2 мМ ЭДТА. Высушите гель и проэкспонируйте с рентгеновской пленкой. Радиоавтограф геля, на котором разделены продукты синтеза первой и второй цепей, а также кДНК, обработанная SI, представлен на рис. 4. Распределение по размерам продуктов синтеза первой цепи отражает распределение по размерам РНК-матрицы. После синтеза второй цепи средний размер продукта примерно удваивается.
Таблица 4. Реакция метилирования .ЕсоЭД-сайтов
