Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 35

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 253 >> Следующая

Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и A,gtll
8$
14. Добавьте равный объем буфера для разведения.
15. Очистите фаг в ступенчатом градиенте CsCl в роторе Beckman SW50.I, как описано Дэвисом и соавт. [11]. Первый раз нанесите фаг на верхнюю часть, а второй раз — на дно градиента.
16. Отберите содержащую фаг зону в минимально возмож-ном объеме. Храните суспензию при 4 °С.
17. Выделите фаговую ДНК путем экстракции формамидом, как описано Дэвисом и соавт. [11]-
18. Средний выход ДНК фага из 1 л культуры составляет
0,25—0,5 мг.
2.5. Методика синтеза и клонирования двухцепочечной кДНК
в Яgt10 и lgt11
Методика синтеза и клонирования двухцепочечной кДНК приведена в табл. 1—9. Текст разделов 2.5.1—2.13 содержит дополнительные объяснения.
2.5.1. Синтез первой цепи кДНК
Методика синтеза первой цепи кДНК приведена в табл. I. Крайне важно, чтобы все реагенты и пластиковая посуда, используемые для синтеза первой цепи, не содержали следов
Таблица 1. Синтез первой цепи кДНК
1. Внесите реагенты в указанном ниже порядке в стерильную микро-центрифужную пробирку на 1,5 мл (конечный объем смеси 50 мкл). Начальный объем воды должен быть таким, чтобы после добавления poly(A)+-PHK и обратной транскриптазы общий объем составил 34 мкл.
2. Добавьте 2 мкг‘> ро1у(А)+РНК в дистиллированной воде. Прогрейте смесь 3 мин при 70 °С и охладите во льду.
3. Добавьте в следующем порядке: 5 мкл десятикратного буфера для синтеза первой цепи2); 5 мкл 10 мМ (ACGT)TP3>, 5 мкл oligo(dT)i2_ia (100 мкг/мл); 1 мкл 5'-[а-32Р]с1СТР; 10—20 единиц4' обратной транскриптазы из ВМП (конечный объем 50 мкл).
4. Проинкубируйте 1 ч при 42 °С.
5. Проткните крышку пробирки иглой. Денатурируйте дуплекс РНК: кДНК в кипящей водяной бане в течение 1,5 мин, затем охладите во льду. Замените крышку с отверстием на новую.
6. Прежде чем перейти к осуществлению следующих стадий (табл. 2), отберите 0,5 мкл продукта реакции для осаждения спиртом и анализа размеров продукта в щелочном агарозном геле (разд. 2.5.3).
!) Если реакция проводится при другой концентрации РНК, следует поддерживать постоянным соотношение РНК : oligo(dT).
2) Десятикратный буфер для синтеза первой цепи содержит 0,5 М трис-НС1 pH 8,5 (измеряется при комнатной температуре); 0,4 М КС1; 0,1 М MgCl2; 4 мМ ДДТ.
3) d(ACGT)TP — это водный раствор, содержащий по 10 мМ dATP, dCTP, dGTP и dTTP (см. разд. 2.2).
4) 1 единица обратной транскриптазы катализирует включение 1 наномоля dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мии при 35 °С, если в качестве матрицы-затравки используется полирнбоаденилат : дезокситимидилат.
А*
.€4
Глава 2
РНКазы. Это касается и обратной транскриптазы. Для проверки обратной транскриптазы на РНКазную активность проинкубируйте несколько единиц фермента с 0,25 мкг суммарной РНК в 50 мМ трис-НС1 pH 7,5; 100 мМ NaCl, 8 мМ MgCl2 при 37 °С .в течение 1 ч. Нанесите РНК на 1%-ный агарозный гель, приготовленный на трис-ацетатном буфере и содержащий '•0,5 мкг/мл этидиумбромида. С помощью источника УФ-излуче-ния проверьте, не деградировала ли РНК- Может оказаться необходимым очистить обратную транскриптазу от примесной РНКазной активности на колонке с Сефакрилом S200, как •описано в работе [18].
Кроме того, необходимо, чтобы при синтезе первой цепи кДНК фермент присутствовал в избытке по отношению к матрице. Протитруйте фермент при постоянной концентрации ;poly(A)+PHK, измеряя количество синтезированной кДНК по свключению радиоактивной метки в кислотонерастворимую •фракцию. После того как убедитесь, что фермент присутствует в избытке, проверьте, линейно ли зависит количество синтезируемой кДНК (определяемое по включению метки в кислотонерастворимый материал) от количества добавленной в реакцию ро1у(А)+РНК. Убедитесь также, что включения метки не происходит при отсутствии в реакционной смеси РНК.
Масса синтезированной кДНК должна составлять от 5 до •50% массы ро1у(А)+РНК. Если известна удельная активность метки, эту величину можно оценить по количеству радиоактивных импульсов, включившихся в ДНК в ходе реакции. Причины плохого включения могут быть следующими:
1. РНК-матрица сильно деградирована.
2. В препарате РНК присутствует ингибитор фермента.
При наличии подходящего зонда деградацию ро1у(А)+РНК
легче всего обнаружить, если разделить препарат в геле, перенести РНК на твердый носитель и прогибридизовать с радиоактивно меченным ДНК-зондом. Ингибитор можно зарегистрировать, смешав РНК с другим препаратом ро1у(А)+РНК, заведомо представляющим собой хорошую матрицу для обратной транскрипции и проверив, как присутствие вашего препарата влияет на матричную активность заведомо хорошей матрицы.
Наконец, необходимо проверить зависимость реакции синтеза первой цепи от oligo(dT)-затравки. При добавлении oligo(dT) включение радиоактивной метки в ДНК должно возрасти не менее чем в 10 раз. Причиной высокого уровня независимого от oligo(dT) включения метки иногда служит синтез кДНК, который обусловлен присутствием остаточных примесей ДНК и (или) рибосомной РНК в препаратах ро1у(А)+РНК. Продукты обратной транскрипции таких молекул мигрируют в щелочном агарозном геле в виде дискретных полос. Независимое от oligo(dT) включение метки иногда удается уменьшить
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed