Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4. Добавьте к продуктам реакции 5 мкл 50 мМ трис-НС1 pH 7,5; 10 мМ MgS04; 200 мМ NaCl и прогрейте 10 мин при 70 °С для инактивации лигазы.
5. Добавьте 1 мкл ?coRI (20 ед2)/мкл) до конечного объема 11,5 мкл ¦и проинкубируйте 1 ч при 37 °С.
6. Остановите реакцию добавлением 0,2 мкл 1 М Ка4ЭДТА.
7. Для удаления избытка линкеров пропустите двухцепочечную кДНК через колонку с Био-Гелем А50т так, как описано в разд. 2.5.8.
!) Объем добавляемого фермента ие должен превышать 10% объема реакции, иначе -концентрация глицерина окажется слишком большой.
2) 1 единица ?coRI полностью расщепляет 1 мкг ДНК pBR322 за 1 ч прн 37 °С.
3. Нанесите продукты реакции на 10%-ный полиакриламидный гель. В качестве контроля нанесите равное количество не-лигированных меченых линкеров. Проводите электрофорез до тех пор, пока бромфеноловый синий не достигнет середины геля. Проэкспонируйте гель с рентгеновской пленкой. Основная часть метки должна содержаться в «лестнице», которую образуют олигомеризованные линкеры.
2.5.7. Присоединение к кДНК липких ЯсоШ-концов
Процесс проводят в две стадии. Сначала синтетические линкеры лигируют с двухцепочечной кДНК. Так как в результате к концам кДНК присоединяются образованные линкерами олигомеры, для удаления лишних линкеров продукты первой реакции расщепляют ЕсоЩ. Процедура описана в табл. 7.
2.5.8. Удаление избыточных fcoRI-линкеров и фракционирование двухцепочечной кДНК по размеру
Фракционирование кДНК по размеру и удаление избытка линкеров проводят в одну стадию, пропуская реакционную смесь при комнатной температуре через колонку с Био-Гелем А50т. Колонку изготавливают из стеклянной трубки длиной 32 см и внутренним диаметром 0,2 см. В нижнюю часть колонки вставьте пробку из пористого полиэтилена или стеклянной ваты. Колонку силиконируйте, промывая ее в течение нескольких минут (под тягой) 1%-ным раствором диметилдихлорсила-на в СНС1з, а затем этанолом. К нижнему концу колонки при помощи парафилма присоедините иглу для инъекций. Иглу вставьте в полиэтиленовую трубку, достаточно длинную для
90
Глава 2
Номер франции
Рис. 5. Кривая элюции кДНК с колонки (хроматография на Био-Геле А50т)(. Двухцепочечную кДНК с присоединенными fcoRI-линкерами фракционировали по размеру по описанной в тексте методике. Фракции по 3 капли (~45 мкл) были собраны и просчитаны в сцинтилляционном счетчике по три-тиевому каналу. (В этом опыте кДНК синтезировали с использованием 5'-[а-32Р] dCTP с большей удельной активностью, чем рекомендовано в тексте.)
соединения колонки с коллектором фракций (полиэтиленовая трубка РЕ20 с внутренним диаметром 0,38 мм и внешним диаметром 1,09 мм изготавливается фирмой Clay-Adams). К верхнему концу колонки через пластиковую трубку присоедините одноразовый пластиковый шприц без поршня, служащий в ка-ществе резервуара. Био-Гель А50т (100—200 меш) промойте несколько раз буфером для колонки (10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 100 мМ NaCl, 1 мМ Ыа3ЭДТА). Перед наполнением Био-Гелем нижнюю часть колонки заполните буфером. Для набивки резервуар заполните Био-Гелем и откройте колонку. Полный объем колонки — около 1 мл. Ее необходимо тщательно промыть (примерно 50 мл буфера), для того чтобы удалить из носителя ингибиторы лигазы.
Для калибровки через колонку пропустите радиоактивно меченные рестриктные фрагменты известной длины (например, меченные по 5'-концам Ят/1-фрагменты pBR322) и проанализируйте фракции при помощи гель-электрофореза. К радиоактивным фрагментам (в 10 мкл ТЕ 7,5) добавьте 1 мкл 0,25%-ного раствора бромфенолового синего в 50%-ном глицерине и нанесите на колонку. Скорость протекания должна быть такой, чтобы краситель перемещался на 1 см приблизительно за 10 мин. Соберите фракции (по 3 капли) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (объем капли ~15 мкл). Удобно использовать микроколлектор фирмы Gilson. Проанализируйте аликвоту каждой фракции на 1,2%-ном агарозном геле. Гель высушите и проэкспонируйте с рентгеновской пленкой. Перед фракционированием кДНК колонку тщательно промойте буфером. После калибровки колонку можно использовать много раз.
Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и A,gtll
91
9 10 11 12 13 14 1& 16 П 18
4И -1631
Jb "511
V, • фт -344
-аго
Рис. 6. Фракционирование по размеру меченной 32Р кДНК на колонке с Био-Гелем А50ш. См. подпись к рисунку 5. Аликвоты фракций 9—18 с колонки наносили на 1,2%-ный агарозный гель. После электрофореза гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой. Размеры стандартов длины указаны
в парах нуклеотидов.
К препарату кДНК добавьте 1 мкл 0,25%-ного раствора бромфенолового синего в 50%-ном глицерине. Отцентрифуги-руйте препарат 30 с в микроцентрифуге для удаления нерастворимых частиц, которые могут нарушить протекание. Нанесите препарат на колонку и установите нужную скорость протекания. Как и раньше, соберите фракции по 3 капли. Закройте пробирки, поместите их во флаконы для сцинтилляционного счетчика и просчитайте на 3Н-канале. Профиль элюции кДНК с колонки приведен на рис. 5.
