Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2.1. Векторы pSV2
Широкое распространение получили эукариотические векторы, сконструированные на базе вектора-прототипа pSV2 (Ховард и Берг, неопубликованные результаты). Схема этого вектора приведена на рис. 1. Прокариотические последовательности, которые несет pSV2, включают ген устойчивости к ампициллину AmpR и область начала репликации бактериальной плазмиды pBR322. Во всех векторах семейства pSV2 указанные последовательности занимают область размером в 2295 нуклеотидных пар, ограниченную позициями 323—2618 (см. полную нуклеотидную последовательность pSV2cat, приведенную в при-
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
411
ampR
Рис. 1. Вектор семейства pSV2. а — промотор ранних генов SV40 (область 1—323 нуклеотидной последовательности pSV2cat); Ь — область 324—3369, включающая бактериальные последовательности, ответственные за репликацию (ori) и ген ampR из pBR322; с — область 3370—4217, содержащая сигнал поли-аденилирования и интрон малого t-антигена SV40; d •— клонированный тест-ген, находящийся под транскрипционным контролем промотора ранних генов SV40. В составе pSV2cat ген CAT занимает область 4218—5003.
ложении). Для инициации синтеза РНК в клетках млекопитающих используется промотор ранних генов вируса SV40. Этот участок в дополнение к сайту инициации транскрипции содержит также 72-нуклеотидный повтор-энхансер; общая длина про-моторного участка — 323 нуклеотида (область 1—323 нуклеотидной последовательности pSV2cat, см. приложение). Векторы на базе pSV2 содержат донорно-акцепторную последовательность сплайсинга в форме интрона малого t-антигена SV40. В векторе pSV2cat этот 610-нуклеотидный фрагмент ограничен позициями 3606—4217. К нему примыкает 988-нуклеотидный фрагмент (позиции 2618—3606 на карте pSV2cat), несущий сигнал полиаденилирования из ранней области SV40. Остальная часть плазмиды (область 4217—0) представляет собой участок для клонирования желаемой кодирующей последовательности.
2.2. Варианты конструкций
Приведенные выше примеры иллюстрируют в целом те функциональные компоненты, которыми должен обладать вектор, используемый для экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих. Понятно, что конкретные векторы могут отличаться друг от друга теми или иными конструктивными особенностями. Например, в их состав могут входить гены, детерминирующие различную лекарственную устойчивость: к ампициллину, тетрациклину или хлорамфениколу. Выбор промотора для экспрессирующего вектора определяется типом реципиентной клетки или же целями исследования. В векторах семейства pSV2 используется промотор ранних генов SV40. Этот регуляторный элемент был выбран потому, что, во-первых, он хорошо изучен
412
Глава 6
Рис. 2. Векторы, в которых в качестве промотора используется длинный концевой повтор (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV). А. Вектор для временной экспрессии pRSVcat. Б, В. Векторы pRSVgpt и pRSVneo, обеспечивающие возможность доминантной селекции. Г. Вектор pRSV-^-глобин позволяет поставить под контроль RSV кодирующую последовательность любого интересующего гена. Нуклеотидная последовательность pRSVneo приведена в приложении.
Все указанные векторы имеют идентичную структуру в области 1—4241.
и, во-вторых, были основания предполагать, что он транскрип-ционно активен во многих типах клеток. Между тем углубленные исследования вирусных промоторов выявили для многих из них определенную видовую избирательность. Эта избирательность оказалась тесно связанной с функционированием других контролирующих генетических элементов, называемых энхансе-рами. Энхансеры интенсивно изучаются, и накопленные к настоящему времени данные говорят о том, что промоторная последовательность для экспрессирующего вектора должна коррелировать с типом реципиентной клетки [1]. Так, например, промотор ранних генов SV40 прекрасно работает в клетках приматов, но гораздо менее эффективен в клетках мыши. Для того же, чтобы получить высокий уровень экспрессии в мышиных клетках, следует использовать в качестве промотора длинный концевой повтор (LTR — от англ. long terminal repeat) вируса саркомы мышей Молони (MSV) [2]. Наиболее широкой специфичностью, по-видимому, обладает промоторная зона LTR
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
413
вируса саркомы Рауса (RSV) [3]. Этот промотор функционирует во всех исследованных клетках млекопитающих и даже в клетках организмов из других таксономических групп, например в клетках дрозофилы. Семейство векторов, содержащих универсальный промотор RSV, показано на рис. 2. Нуклеотидная последовательность pRSVneo приведена в приложении в конце главы. Все RSV-векторы [4] имеют одинаковую первичную структуру в области 1—4241.
2.3. Индуцибельные промоторы
В ряде случаев высокоэффективная конститутивная экспрессия чужеродного гена оказывается нежелательной. В частности, высокое содержание в клетке продуктов некоторых генов при их конститутивной экспрессии может обусловливать цитотокси-ческий эффект. Поэтому довольно часто для регулирования экспрессии клонированного гена, введенного в клетки млекопитающих, используют индуцибельные промоторы. Эти контролирующие элементы могут быть состыкованы с любой кодирующей последовательностью; в результате транскрипционная активность последней оказывается под контролем соответствующих стимулов. В качестве примеров индуцибельных промоторов, которые с успехом используются в экспрессирующих векторах, приведем промоторы белков теплового шока [5], промоторы металлотионеинов мыши и человека [6—8], промотор гормона роста [9J, а также длинный концевой повтор вируса рака молочной железы мыши (MMT-V) [10].. Эти контролирующие генетические элементы используются для экспрессии генов как во временных трансформантах, так и в стабильно трансформированных клетках.
