Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
408
Глава 5
¦10. Lis I. Т., Simon J. A., Sutton C. A. Cell, 35, 403 (1983).
11. Stelter H., Pirrotta V. EMBO J„ 4, 163 (1985).
12. Engels W. R. Annu. Rev. Genet., 17, 315 (1983).
13. Bregliano J. C„ Kidwell M. G. In: Mobile Genetic Elements, Shapiro J. A. (ed.), Academic Press, New York, pp. 363, 1983.
14. O’Hare K., Rubin G. M. Cell, 34, 25 (1983).
15. Karess, Rubin G. M. Cell, 38, 135 (1984).
16. Rubin G. М., Spradling A. C. Nucleic Acids Res., 11, 6341 (1983).
17. Bender W., Spierer P., Hogness D. S. J. Mol. Biol., 168, 17 (1983).
18. Lindsley D„ Grell R. Genetic Variations of Drosophila melanogaster, published by Carnegie Inst., Washington, 1968.
19. Goldberg D. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5794 (1980).
20. Benyajati C., Wang N., Reddy A., Weinberg E., Sofer W. Nucleic Acids Res.,
8, 5649 (1980).
21. Benyajati C., Spoerel N., Hamerle II., Ashburner M. Cell, 33, 125 (1983).
22. Spradling, Rubin. Cell, 34, 47 (1983).
23. Bingham P. M„ Kidwell M. G„ Rubin G. M. Cell, 29, 995 (1982).
24. Simmons М., O’Hare K., Rubin G. M., personal communication.
25. Ashburner М., Thompson J. N. In: The Genetics and Biology of Drosophila, Academic Press, Vol. 2a, pp. 2 (1978).
26. Zucker C„ Rubin G. М., personal communication.
27. Fullilove S. L., Jacobson A. G. In: The Genetics and Biology of Drosophila,
Academic Press, Vol. 2c, pp. 106 (1978).
28. Southern E. M. J. Mol. Biol., 98, 503 (1975).
29. Gall J. G., Pardue M. L. In: Methods in Enzymology, Academic Press,
Vol. 21D, pp. 470 (1971).
30. Langer-Safer P. R„ Levine М., Ward D. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4381 (1982).
31. Hazelrigg T„ Levis R„ Rubin G. М., personal communication.
ГЛАВА 6
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Корнелия Горман
1. Введение
По мере развития и совершенствования рекомбинантной технологии особую важность приобрели исследования, направленные на разработку методов переноса генов в эукариотические клетки. Данная глава посвящена описанию современных методических процедур, позволяющих осуществлять перенос генов с помощью векторов невирусной природы; особое внимание уделено двум наиболее распространенным методам — «кальций-фосфатному» и «ДЕАЕ-декстрановому». Описаны векторы, применяющиеся в самых разных экспериментах по генетическому переносу, и проведен подробный анализ соответствующих методик. Транспозированные гены могут сохраняться в клетке непродолжительное время, а могут и стабильно изменять ее генетическую структуру. Для временной (transient) трансформации ДНК, вводимой в культивируемые клетки, необязательно интегрироваться в клеточный хроматин для того, чтобы экспрессировать заключенную в ней генетическую информацию. Экспрессия введенной плазмидной ДНК начинается через 12 ч после ее проникновения в клетку и может продолжаться в клетках млекопитающих в общей сложности в течение 80 ч. При перманентной трансформации плазмидная ДНК внедряется в клеточный геном — возникает стабильно трансформированная клеточная линия. Ниже обсуждаются возможности и области применения этих двух экспериментальных приемов — временной и стабильной трансформации клеток млекопитающих. Выбор же конкретной методики, очевидно, зависит от поставленной экспериментальной задачи. В настоящей главе мы рассмотрим также вопросы, связанные с решением важной проблемы — повышения эффективности переноса хромосомных генов.
Многие эксперименты предполагают использование в качестве источника генетического материала клеточной ДНК. В этом случае селекция трансформантов должна основываться на фенотипических изменениях, которые возникают в реципиентных клетках после введения в них клеточной ДНК. Успешное проведение подобных экспериментов требует высокоэффективной стабильной трансформации. Поэтому в ряде случаев целесообразнее использовать плазмидный маркер для котрансфекции с геномной ДНК: первичный скрининг трансформированных кле-
410
Глава 6
ток на доминантно маркированный вектор позволяет легко из* бавиться от фона нетрансформированных клеток. Затем, если это необходимо, можно провести вторичный скрининг на ожидаемые фенотипические изменения. Как и в случае большинства новых методов, в исследовательской среде уже сформировалось свое мнение о всех «за» и «против» любого из перечисленных выше подходов. Поэтому мы постараемся быть предельно объективными в анализе сильных и слабых сторон предлагаемых экспериментальных приемов.
2. Векторы, используемые для экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих
Все плазмидные векторы, используемые в экспериментах по генетическому переносу, содержат четыре основных функциональных компонента. Во-первых, это прокариотические последовательности, представляющие бактериальную область начала репликации и маркер лекарственной устойчивости. Эти последовательности обеспечивают размножение и селекцию плазмид в бактериальном хозяине. Во-вторых, это эукариотические элементы, контролирующие инициацию транскрипции, в частности промоторные и энхансерные последовательности [1]. Третий тип функциональных компонентов большинства экспрессирующих векторов — последовательности, обеспечивающие процессинг транскриптов. Далеко не все векторы содержат интроны для контроля возможного сплайсинга, однако сигналы полиадени-лирования обязательно должны присутствовать, поскольку лишь полиаденилированные транскрипты эффективно транслируются в клетках млекопитающих. И наконец, четвертый компонент — это тест-ген. Из приведенных ниже примеров мы увидим, что в его роли могут выступать бактериальный ген, поставленный под контроль эукариотического элемента, комплементарная ДНК-копия специфической РНК или даже клонированный фрагмент геномной ДНК.
